陈颖颖 杜梦梦 李冬霞 罗莎 周同亮 陶庆文

【摘 要】目的：采用不同浓度腺嘌呤进行肾虚骨关节炎复合模型建模，建模成功后对其进行肾虚与骨关节炎各项指标测定，选择最适腺嘌呤建模浓度。方法：将45只SD大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，腺嘌呤高（150 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1）剂量组，每组9只。造模成功后检测大鼠肾虚以及骨关节炎各项指标，包括大鼠证候评分、皮质酮（CORT）、雌二醇（E2）、睾酮（T）含量，关节大体情况，HE染色和Mankin's评分。记录大鼠死亡率。结果：腺嘌呤高剂量组大鼠证候评分高于腺嘌呤中剂量组与低剂量组（P < 0.05）。与空白对照组、模型对照组比较，腺嘌呤高、中剂量组E2、E2/T、CORT均增高（P < 0.05），T降低（P < 0.01）。模型对照组和腺嘌呤高、中、低剂量组大鼠膝关节表面不光滑，潮线不完整，软骨厚薄不均匀。与空白对照组比较，模型对照组，腺嘌呤高、中、低剂量组Mankin's评分差异有统计学意义（P < 0.01）。腺嘌呤高剂量组死亡率为44%，其余4组无死亡。结论：腺嘌呤浓度100 mg·kg-1是最适肾虚骨关节炎复合模型建立浓度。

【关键词】 骨关节炎;腺嘌呤;肾虚;动物模型;浓度

【ABSTRACT】Objective：To establish compound models of osteoarthritis with kidney deficiency by using different concentrations of adenine.After the models are established successfully，the indexes of kidney deficiency and osteoarthritis were measured and the optimal concentration of adenine was selected.Methods：Forty-five SD rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，groups with high adenine（150 mg·kg-1），medium adenine（100 mg·kg-1），low adenine（50 mg·kg-1），9 rats in each.The indexes of kidney deficiency and osteoarthritis were measured after the models were established successfully，including syndrome score，cortisol（CORT），estradiol（E2），testosterone（T），general situation of joints，HE staining and Mankin's score.The mortality of rats was recorded.Results：The syndrome score of high dose group was higher than that of middle dose group and low dose group（P < 0.05）.Compared with blank control group and model control group，E2，E2/T and CORT of high and medium dose adenine group were higher（P < 0.05），while T was lower（P < 0.01）.In the model control group and high，middle and low dose adenine group，the surface of knee joint was not smooth，the tide line was not complete，and the thickness of cartilage was not uniform.Compared with the blank control group，there was a significant difference in Mankin's score between the model control group and the high，medium and low dose adenine group（P < 0.01）.The mortality rate of the high adenine group was 44%，and there were no death in the other four groups.Conclusion：100 mg·kg-1 is the best concentration for the establishment of the compound model of osteoarthritis with kidney deficiency.

【Keywords】 osteoarthritis;adenine;kidney deficiency;animal model;concentration

骨關节炎（osteoarthritis，OA）是一种关节退行性病变，好发于中老年人，随着人口老龄化的加重，患病人数也逐年升高[1-3]。中医学认为，本病以肾虚为本，临床上使用补肾中药多收获良效[4-5]。OA基础实验常需制备肾虚OA动物模型。在前期的实验中发现，腺嘌呤法与Hulth法联合制备的肾虚OA模型，肾虚证候较其他方法更明显，且该方法造模较为简单，收效显著;然不足之处是常规剂量（200 mg·kg-1）的腺嘌呤干预OA大鼠，死亡率较高，这可能由于OA大鼠前期已经过一次手术损伤，身体较弱所致。因此，使用复合模型制备肾虚OA模型时，选择合适的腺嘌呤浓度对模型制备成功尤为重要[6]。本实验旨在探索最适宜的腺嘌呤浓度，为肾虚OA复合模型制备提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 6周龄SPF级雄性SD大鼠45只，购自中国药品生物制品检定所，实验动物生产许可证号SCXK（京）2014-001，饲养于中日友好医院临床研究所动物饲养室，使用许可证号SYXK（京）2016-0043。

1.2 主要试剂 腺嘌呤（Sigma，WXBC4019V）;大鼠雌二醇（E2）试剂盒（BECKMAN，723550）;大鼠睾酮（T）试剂盒（BECKMAN，723553）;大鼠皮质酮（CORT）放射免疫分析试剂盒（中国北京北方科技研究所，20180120）。

1.3 主要仪器 贝克曼库尔特全自动化学发光免疫分析仪（BECKMAN，UniCelDxI 800）;珀金埃尔默PekinElmer放射免疫分析仪（PekinElmer，2470）;舒式切片机（樱花病理仪器株式会社，CRM-44）;组织包埋机（樱花病理仪器株式会社，5235）;旋转式组织脱水机（樱花病理仪器株式会社，4634）;石蜡溶蜡箱（樱花病理仪器株式会社，PM-401）;双人显微镜（OLYMPUS，BH-2）。

2 方 法

2.1 动物分组与干预 将45只6周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，腺嘌呤高、中、低剂量组，每组9只。空白对照组不进行造模处理，其余4组先以Hulth法进行OA造模，方法如下：采用质量分数为10%的水合氯醛4 mL·kg-1麻醉;手术前手术区剃毛以及消毒，取髌韧带做横向切口，切断髌韧带、内侧副韧带、前后交叉韧带，取出内侧半月板，双层缝合伤口;术后青霉素肌注16万U预防感染[5]。术后4 d大鼠可常规行走，伤口基本愈合，此时腺嘌呤灌胃，腺嘌呤高剂量组予150 mg·kg-1，中剂量组予100 mg·kg-1，低剂量组予50 mg·kg-1，连续灌胃28 d[7]。

2.2 取 材 大鼠麻醉后行心脏取血，所获得的全血经过离心机以1700 r·min-1离心10 min，离心半径20 cm，分离上清备用;取手术侧膝关节进行HE染色。

2.3 检测指标及方法 造模成功后，分别检测肾虚及OA指标，包括肾虚证候评分表，E2、T、E2/T及CORT含量[8]，关节表面大体形态，HE染色及Mankin's评分。统计各组死亡率，做可行性分析。其中E2、T委托中日友好医院检验科进行检测，CORT委托北京生命科学研究所进行检测。

2.3.1 肾虚检测指标及方法 根据《辨证论治实验方法学》提供的动物辨证方法，对大鼠肾虚证候进行评分以利于辨证。检测肾虚相关指标E2、T、E2/T及CORT含量。肾虚证候评分参照文献[9]。

2.3.2 OA检测指标及方法 对新鲜组织关节行大体观察，对手术侧膝关节进行脱钙，行HE染色及Mankin's评分[10]。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，采用单因素ANOVA分析;非正态数据采用非参数检验。数据若方差齐，采用LSD、SNK检验;若方差不齐，两两比较采用Tamhane's和Dunnett's检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 肾虚检测结果

3.1.1 各组大鼠证候评分比较 空白对照组及模型对照组不满足肾虚证候标准，腺嘌呤高、中、低剂量组均满足肾虚证候标准。其中腺嘌呤高剂量组大鼠证候评分高于腺嘌呤中、低剂量组（P < 0.05）。见表1。

3.1.2 各组大鼠E2、T、E2/T及CORT含量比较 与空白对照组比较，腺嘌呤高剂量组E2、E2/T、CORT均增高，T降低（P < 0.01）;腺嘌呤中剂量组E2、CORT增高（P < 0.01），E2/T增高（P < 0.05）;腺嘌呤低剂量组E2增高（P < 0.05）。与模型对照组比较，腺嘌呤高剂量组E2、E2/T、CORT均增高，T降低（P < 0.01）;腺嘌呤中剂量组E2、CORT增高（P < 0.01），E2/T增高（P < 0.05），T降低（P < 0.05）。见表2。

3.2 OA检测结果

3.2.1 各组大鼠膝关节表面大体形态 空白对照组大鼠膝关节表面光滑，颜色亮泽，无溃疡;模型对照组和腺嘌呤高、中、低剂量组大鼠膝关节表面不光滑，颜色晦暗，有溃疡。

3.2.2 各组大鼠HE染色结果 空白对照组可见软骨表面光滑，潮线完整;模型对照组和腺嘌呤高、中、低剂量组大鼠关节表面不光滑，潮线不完整，软骨厚薄不均匀。见图1。

3.2.3 各组大鼠Mankin's评分比较 模型对照组和腺嘌呤高、中、低剂量组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）;模型对照组，腺嘌呤高、中、低剂量组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.3 死亡率 造模结束后，腺嘌呤高剂量组大鼠死亡4只，死亡大鼠异常消瘦，解剖死亡大鼠可见其肾脏较正常大鼠大，且颜色偏白，两肾脏包膜下有明显积液，大鼠可能死于较高剂量的腺嘌呤导致的肾功能衰竭。但由于发现时大鼠已经死亡，不能做相应的检测。腺嘌呤高剂量组死亡率为44%，其余4组均无死亡。

4 讨 论

OA是臨床上常见的疾病，肾虚是主要病因[11-12]，因此肾虚OA动物模型的制备是研究临床问题的基础。前期实验发现，肾虚造模选择腺嘌呤最优[13-15]，OA造模选择Hulth法最优[16-18]，肾虚OA需要复合模型，因此需要将两者复合进行造模。但两种不同造模方法之间会存在影响，因此复合模型并不是模型之间简单的叠加[19-20]。本实验中，Hulth法为手术方法，不需每日干预，所以先进行Hulth法造模;腺嘌呤法需每日灌胃，需要待手术之后进行该操作。考虑到手术对大鼠的损伤，因此腺嘌呤剂量的选择不能过大。前期实验发现，200 mg·kg-1腺嘌呤剂量大鼠死亡率过高，无法完成整个造模，所以本次实验选择的剂量为150 mg·kg-1、100 mg·kg-1和50 mg·kg-1。

复合模型在OA表现方面，通过HE染色及Mankin's评分发现，模型对照组和腺嘌呤高、中、低剂量组大鼠均呈现OA表现，且4组之间Mankin's评分比较，差异无统计学意义（P > 0.05），表明采用Hulth法进行OA造模收效良好。

复合模型在肾虚表现方面，发现腺嘌呤150 mg·kg-1干预大鼠，肾虚证候学指标与理化指标较腺嘌呤中、低剂量组好，但150 mg·kg-1干预大鼠，大鼠死亡率为44%，可行性较弱;腺嘌呤100 mg·kg-1干预大鼠，肾虚结果较高剂量组次之，死亡率为零;腺嘌呤50 mg·kg-1干预大鼠，大鼠肾虚表现较弱，多数指标与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

综上所述，腺嘌呤中剂量组无论在肾虚方面还是OA方面均表现出良好的模型特征，且死亡率为零，可操作性强。因此，在进行肾虚OA模型造模时，可以选择腺嘌呤100 mg·kg-1剂量进行造模干预。

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收稿日期：2019-09-16;修回日期：2019-10-23