HPLC法研究三种皮类药材不同贮藏期药效成分的含量变化

2020-09-19武继斌郭玉洁李少彤赵丽娟褚洪标梁兆昌

井冈山大学学报(自然科学版) 2020年4期

武继斌，郭玉洁，李少彤，赵丽娟，褚洪标，梁兆昌

武继斌，郭玉洁，李少彤，赵丽娟，*褚洪标，梁兆昌

(井冈山大学医学部，江西，吉安 343009)

利用高效液相色谱法探究杜仲、厚朴和黄柏三种皮类药材不同贮藏期药效成分的含量变化。分别采用回流、超声和闪式三种方式对同批贮存一年以及贮存五年的杜仲、厚朴和黄柏三种皮类药材进行提取，并利用高效液相色谱法对提取液中有效成分进行定量分析。与贮藏期一年的药材相比，经过5年的贮存，三种皮类药材的药效物质含量均随着贮藏期延长或多或少的降低，其中杜仲皮中桃叶珊瑚苷的含量减少70 %以上；厚朴皮中厚朴酚及和厚朴酚的含量减少1 %以下；黄柏皮中盐酸小檗碱的含量减少10 %以上。三种皮类药材的药效物质在贮藏期变化总体有相似的规律，贮藏时间对杜仲皮皮中桃叶珊瑚苷的含量影响较大，对厚朴皮中厚朴酚与和厚朴酚的含量影响最小，而对黄柏皮中盐酸小檗碱的含量影响较小。研究结果为三种皮类药材的质量控制提供了科学依据。

杜仲；桃叶珊瑚苷；厚朴；厚朴酚；和厚朴酚；黄柏；盐酸小檗碱；高效液相色谱法

中药材是季节性、地域性生产的药品，贮藏是中药材流通使用过程中的一个重要环节。贮藏年限对药材质量的影响，不仅关系到药材的使用，而且影响药材的生产、经营[1-2]。如果一种药材耐贮藏性好，其生产、经营、使用的风险就小。

杜仲、厚朴、黄柏（简称三木）属木本皮类药材，都是用途广泛的中药材，其资源丰富，在医学上具有重要的临床使用价值。中药材中所指杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥树皮，是中国名贵滋补药材，含有桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷酸、黄酮等多种成分，具有降压、利尿等作用，在临床上常用于补肝肾、强筋骨、安胎、高血压等多种症状[3-4]。厚朴是木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的树皮，主要活性成分厚朴酚与和厚朴酚具有抗菌、抗溃疡及防龋等作用，《中国药典》将其作为厚朴质量的主要控制标准[5-6]。黄柏是芸香科植物黄柏或黄皮树的树皮，含有小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、掌叶防己碱等多种生物碱，常用于清热、燥湿、泻火、解毒、热痢、黄疸等多种症状[7-8]。

药材贮藏期间的质量变化，其关键因素是由药材特性决定的, 不同来源的药材具有不同的特性。由于皮类药材具有相似的特性，本研究通过对不同贮藏期的杜仲、厚朴、黄柏等三种皮类药材进行取样，测定其药用有效成分，分析不同贮藏期对药材质量有无影响，从而为杜仲、厚朴、黄柏提供合理、科学的贮藏依据，便于指导临床用药。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-A循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DG-160中药粉碎机（瑞安飞达药材器械厂）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；SL-250型超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司）；ZHBE-50闪式提取器（河南智晶生物科技发展有限公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器）。

1.2 试药

杜仲、厚朴和黄柏样品于 2014 年 8 月采集于江西省井冈山，自然风干，由井冈山大学医学院生药学教研室梁兆昌教授鉴定为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides）的干燥树皮、木兰科植物厚朴( Magnolia officinalis) 的干燥树皮、芸香科植物黄皮树（Phellodendron chinense）的干燥树皮。对照品桃叶珊瑚苷（南京草本源生物科技有限公司，批号479-98-1）、厚朴酚 (中国食品药品检定研究院，批号110729-200412 )、和厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号 110730-201313)、盐酸小檗碱（北京盛世康普化工技术研究院，批号633-65-8）；甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 超声提取供试品溶液

精密称取杜仲、厚朴、黄柏药材粉末各10 g，包括贮藏期1年期样品（于2015年8月样品含量测定）和贮藏期5年期样品（于2019年8月样品含量测定），置锥形瓶中，精密加甲醇 100 mL，封口，于超声提取器（功率120 W，频率40 kHz）中超声处理30 min，取出，过滤，收集滤液；药渣重复上述步骤再提取1次，过滤，合并滤液，定容至200 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，收集滤液。

2.1.2 回流提取供试品溶液

精密称取杜仲、厚朴、黄柏药材粉末各10 g，置于500 mL 圆底烧瓶中，精密加甲醇 100 mL，于恒温水浴锅中 100 ℃回流 60 min，取出，放冷，过滤，收集滤液；药渣重复上述步骤再提取1次，过滤，合并滤液，定容至200 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，收集滤液。

2.1.3 闪式提取供试品溶液

精密称取杜仲、厚朴、黄柏药材粉末各10 g，置于500 mL 圆筒中，加入甲醇 100 mL，设置闪式提取器工作电压为50 V，提取时间 10 min，过滤，收集滤液；药渣重复上述步骤再提取1次，过滤，合并两次滤液，定容至 200 mL，用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，收集滤液。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 桃叶珊瑚苷对照品溶液的制备

精密称取桃叶珊瑚苷对照品 3.0 mg 置于 10 mL 容量瓶中，按流动相比例加甲醇和水至刻度线，摇匀，得到对照品溶液浓度为 0.3 mg/mL。

2.2.2 厚朴酚与和厚朴酚对照品溶液的制备

分别精密称取厚朴酚与和厚朴酚对照品 15.8 mg和7.0 mg，分别置于 10 mL 容量瓶中，按流动相比例加甲醇和水至刻度线，摇匀，得到对照品溶液浓度为 1.58 mg/mL和0.7 mg/mL。

2.2.3 盐酸小檗碱对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品10 mg置于10 mL容量瓶中，按流动相比例加乙腈和磷酸溶液至刻度线，摇匀，得到对照品溶液浓度为 1 mg/mL。

2.3 色谱条件

杜仲的色谱条件：ZORBX-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水溶液（5:95）；检测波长 203 nm；流速 1 mL / min；柱温 25℃；进样量 10 μL。厚朴的色谱条件：ZORBX-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（75:25）；流速1 mL/min；检测波长294 nm；柱温25℃；进样量10 μL。黄柏的色谱条件：ZORBX-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50:50，含0.1%的十二烷基硫酸钠）；流速1 mL/min；检测波长265 nm；柱温25℃；进样量10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

取“2.2.1”项配制的桃叶珊瑚苷对照品储备液，加适量流动相分别配制成以下6个浓度梯度的对照品溶液：300.00、150.00、75.00、37.50、18.75、9.375 μg/mL。在“2.3”条件下，分别测定其峰面积。以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y = 7.2963X + 77.159（r = 0.9995），在9.375 ~ 300.00 μg / mL 范围内与峰面积的线性关系良好。

取“2.2.2”项配制的厚朴酚与和厚朴酚对照品储备液，加适量流动相分别配制成以下6个浓度梯度的对照品溶液：1580.00、790.00、355.00、197.5.00、98.75、49.375 μg/mL和700.00、350.00、175.00、87.50、43.75、21.375 μg/mL。在“2.3”条件下，分别测定其峰面积。以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y = 8.6628X - 97.793 （r = 0.9995）和Y = 9.4198X + 159.15（r = 0.9996）。厚朴酚与和厚朴酚分别在49.375~580.00 μg/mL和21.375 ~700.00 μg/mL 范围内与峰面积的线性关系良好。

取“2.2.3”项配制的盐酸小檗碱对照品储备液，加适量流动相分别配制成以下6个浓度梯度的对照品溶液：1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL，在“2.3”条件下，分别测定其峰面积。以浓度（μg / mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y = 26.463X + 164.17（r = 0.9996），在31.25~1000.00 μg/mL范围内与峰面积的线性关系良好。

2.4.2 精密度实验

取含桃叶珊瑚苷 75.00 μg/mL 的对照品溶液，在“2.3”色谱条件下连续进样 5 次，测定峰面积，求得桃叶珊瑚苷的RSD（n = 5）0.9 %，表明精密度良好。取含厚朴酚与和厚朴酚355.00 和175.00 μg/mL 的对照品溶液，在“2.3”色谱条件下连续进样 5 次，测定峰面积，求得厚朴酚的RSD（n = 5）为0.8 %，和厚朴酚的RSD（n = 5）为0.2 %，表明精密度良好。取含盐酸小檗碱250.00 μg/mL 的对照品溶液，在“2.3”色谱条件下连续进样 5 次，测定峰面积，求得盐酸小檗碱的RSD（n = 5）为 0.6 %，表明精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

分别取同一杜仲、厚朴和黄柏供试品分别于 0，2，4，6，8，10 h 时，在“2.3”项条件下进样，测定峰面积，求得桃叶珊瑚苷、厚朴酚、和厚朴酚、盐酸小檗碱的RSD（n = 5）分别为0.9 %、0.6 %、0.2 % 和1.1 %，说明待测组分在 12 h 内具有良好的稳定性。

2.4.4 重复性实验

分别称取杜仲、厚朴和黄柏粉末各5份，每份10 g，按照“2.1”项下方法制得供试品溶液，分别在“2.3”项条件下进样，测定峰面积。求得桃叶珊瑚苷、厚朴酚、和厚朴酚、盐酸小檗碱RSD分别为0.5 %、0.4 %、0.5 % 和0.3 %，表明本方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率实验

分别称取杜仲、厚朴和黄柏粉末各5份，每份10 g，分别加入一定量的桃叶珊瑚苷、厚朴酚、和厚朴酚、盐酸小檗碱对照品，按照“2.1”项方法操作提取，制得供试品溶液，分别在“2.3”项条件下进样，测定峰面积，计算回收率，结果显示桃叶珊瑚苷、厚朴酚、和厚朴酚、盐酸小檗碱平均回收率为 97.4 %、98.9 %、98.1 %、97.6 %，其 RSD 分别为2.3 %、1.7 %、1.9 %、2.0 %。

3　结果

3.1 杜仲样品测定

按照“2.1.1”项方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样测定。对照品桃叶珊瑚苷（aucubin）及供试品的HPLC 图谱见图 1。利用峰面积，由线性方程计算得到 aucubin的含量，实验结果见表1。

图1 杜仲皮桃叶珊瑚苷（aucubin）对照品（A）和供试品（B）的HPLC色谱图

表1 杜仲皮不同贮藏期桃叶珊瑚苷的含量变化

中药常用的提取方法有超声提取和回流提取等方法，可以很好地表现出各种药材中有效成分的含量，而闪式提取也是近年发展的先进方法，本次实验采用上述三种方式对药材进行提取。杜仲皮中桃叶珊瑚苷，其中水浴加热回流提取中含量差为每10g药材差21.009 mg，减少的比重为74.957%；超声提取中含量差为每10 g药材差21.212 mg，减少的比重为72.846%；闪式提取中含量差为每10g药材25.790 mg，减少的比重为75.546%，三种不同的提取方式得到的桃叶珊瑚苷的比重变化差异不大。上述实验数据显示贮藏时间对桃叶珊瑚苷的含量有较大影响，贮藏时间为5年的杜仲皮中桃叶珊瑚苷含量明显低于当年期杜仲皮中桃叶珊瑚苷含量。实验结果表明，如要利用杜仲皮中的活性成分桃叶珊瑚苷，需注意贮藏时间对其药效的影响。

3.2 厚朴样品测定

按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样测定。对照品厚朴酚(magnolol)、和厚朴酚(honokiol) 及供试品HPLC图谱见图2。利用峰面积，由线性方程计算得到magnolol、honokiol的含量，实验结果见表2和表3。

图2 厚朴皮厚朴酚( magnolol)（A）、和厚朴酚( honokiol)（B）对照品及供试品（C）HPLC色谱图

表2 厚朴皮不同贮藏期厚朴酚的含量变化

表3 厚朴皮不同贮藏期和厚朴酚的含量变化

本次实验用三种方式提取厚朴皮中厚朴酚与和厚朴酚，其中水浴加热回流提取中厚朴酚与和厚朴酚含量差为每10 g药材分别为1.180 mg和0.371 mg，减少的比重分别为0.004%和0.001%；超声提取中厚朴酚与和厚朴酚含量差分别为每10g药材分别为5.725 mg和6.683 mg，减少的比重分别为0.020% 和0.028%；闪式提取中厚朴酚与和厚朴酚含量差分别为每10g药材分别为3.986 mg和2.001 mg，减少的比重分别为0.013% 和0.008%。对比数据得出贮藏时间对厚朴酚与和厚朴酚的含量影响较小，贮藏时间为5年的树皮中厚朴酚和和厚朴酚的含量与当年期树皮中厚朴酚与和厚朴酚的含量变化不大。如要利用厚朴皮中的厚朴酚和和厚朴酚，贮藏时间对其药效影响不大。

3.3 黄柏样品测定

按照“2.1.3”项方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样测定。对照品盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）及供试品的HPLC 图谱见图 3。利用峰面积，由线性方程计算得到 berberine hydrochloride的含量，实验结果见表4。

图3 黄柏皮盐酸小檗碱(berberine hydrochloride)对照品（A）及供试品（B）HPLC色谱图

表4 黄柏皮不同贮藏期盐酸小檗碱的含量变化

本次实验用三种方式提取黄柏皮中盐酸小檗碱，其中水浴加热回流提取中含量差为每10 g药材差62.445 mg，减少的比重为13.037 %；超声提取中含量差为每10 g药材差51.933 mg，减少的比重为10.217 %；闪式提取中含量差为每10 g药材69.957 mg减少的比重为14.317 %。对比数据得出贮藏时间对盐酸小檗碱的含量有一定影响，贮藏时间为5年的树皮中盐酸小檗碱含量低于当年期树皮中盐酸小檗碱含量。如要利用黄柏皮中的盐酸小檗碱，需注意贮藏时间对其药效的影响。

目前的研究以杜仲、厚朴和黄柏三种皮类药材作为对象，利用三种方式提取药材中的主要活性成分，比较同一药材贮藏期1年与5年活性成分的含量变化。统计分析实验结果，与贮藏期1年的药材相比，经过5年的贮存，三种皮类药材的药效物质含量均随着贮藏期延长或多或少的降低，其中杜仲皮中桃叶珊瑚苷的含量减少70%以上；厚朴皮中厚朴酚及和厚朴酚的含量减少1%以下；黄柏皮中盐酸小檗碱的含量减少10%以上。

4 讨论

有关文献[9-14]报道表明，中药常用的提取方法有超声提取和回流提取等方法，可以很好地表现出各种药材中有效成分的含量。也可采用传统浸泡法提取，但是提取工艺繁琐，费时费力，且提取率不高。近几年发展的闪式提取法由于具有快速、完全、高效等特点，得到了快速发展和广泛应用[15]。因此，本实验采用超声、回流和闪式提取三种方法，对三种皮类药材进行提取并测定其含量。从三种药材有效成分的提取方法来看，超声提取、回流提取及闪式提取比较，有效成分的含量无显著性差异。

关于天然药物中桃叶珊瑚苷、厚朴酚、和厚朴酚及盐酸小檗碱含量测定的色谱条件不一。本实验在借鉴前期三种皮类药材含量测定色谱条件基础上，结合前期研究方法[16-17]，采用前述的色谱分析条件，实验结果表明在上述色谱条件峰形对称性较高，无拖尾现象，且其与其他成分分离度、重现性好，三种皮类药材供试品在测定时均取得了较好的效果。

研究表明，杜仲中桃叶珊瑚苷随着贮藏期的延长，其含量下降明显，与其本身结构的稳定性关系密切。桃叶珊瑚苷属于环烯醚萜类成分，该类型成分结构不稳定，易发生结构改变。对于厚朴和黄柏二种皮类药材，由于其主要活性成分厚朴酚、和厚朴酚及盐酸小檗碱的结构稳定，随着贮藏时间的延长，其含量并没有发生很多的变化。中药活性成分复杂多样，不同的化学结构稳定性不同，针对同一中药中不同类型药效物质变化不尽不同。即使针对同一中药中的同一物质，由于各地气候条件不同，对其含量的影响也呈现出差异。目前对中药贮藏期的研究相对单一，仅对中药某一指标成分进行研究，而没有对中药药效物质的整体性综合研究；中药在贮藏过程中药效物质发生变化，其临床疗效是否也受到影响也需要进一步深入研究[18]。因此在以后的研究中，应结合中药中药效物质自身性质与贮藏条件，阐明贮藏机理，明确中药贮藏期限，科学合理地贮藏养护中药，确保临床用药安全。同时可以根据不同的临床需求选择不同贮藏期中药，综合利用中药资源。

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CONTENT VARIATION OF PHARMACODYNAMICS COMPONENTS IN THREE CORTEX HERBS UNDER DIFFERENT STORAGE PERIODS BY HPLC

WU Ji-bin, GUO Yu-jie, LI Shao-tong, ZHAO Li-juan,*CHU Hong-biao, LIANG Zhao-chang

(School of Medicine, Jinggangshan University, Ji'an, Jiangxi 343009, China)

To determine the optimal storage periods of,, and, the content variation of the pharmacodynamics components in three cortex herbs under different storage periods was tested by HPLC.The methanol extracts of three cortex herbs from same batch of samples of one-year and five-year storage periods were obtained by reflux, ultrasonic, and smashing tissue extraction technology and the contents of pharmacodynamics components were determined by HPLC.After five years storage periods, there was a significant decrease in the contents of aucubin in;there was no significant difference in the contents of magnolol and honokiol in; however, there was a significant increase in the contents of berberine hydrochloride in, respectively.The storage time has a great influence on the contents of aucubin in, a little influence on the contents of magnolol and honokiol in, and berberine hydrochloride in. The study might provide a scientific basis for the quality control of three cortex herbs.

; aucubin;; magnolol; honokiol;; berberine hydrochloride; HPLC

R917/R284.1

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.04.016

1674-8085(2020)04-0083-08

2020-03-06；

2020-04-17

江西省教育厅科技计划项目(GJJ150769)；全国中药资源普查项目（财社[2018] 43号）

武继斌(1995-)，男，河南洛阳人，井冈山大学医学部药学专业2016级本科生(E-mail:978775897@qq.com);

郭玉洁(1997-)，女，河南焦作人，井冈山大学医学部药学专业2016级本科生(E-mail:1049145346@qq .com);

李少彤(1997-)，女，河南滑县人，井冈山大学医学部药学专业2016级本科生(E-mail: 921168991@qq.com);

赵丽娟(1997-)，女，江西赣州人，井冈山大学医学部药学专业2016级本科生(E-mail: 1661659279@qq.com);

*褚洪标(1969-)，男，河南商丘人，副教授，博士，主要从事天然药物化学研究(E-mail: hongbiaochu@163.com);