黎琴文，黄小燕

1三峡大学人民医院·宜昌市第一人民医院，湖北宜昌 443000;2兰州大学第一医院

周围神经慢性卡压损伤指周围神经在特定部位受到周围组织的压迫，引起周围神经电生理学改变，从而导致神经支配区疼痛、感觉及运动功能障碍等[1,2]。慢性神经卡压损伤可导致神经组织微血管缺血改变，加重神经束膜水肿、增厚及局部纤维化，阻碍周围神经对靶器官的营养作用，加剧肢体运动功能的逐步丧失[3]。该病对患者的心理和社会功能影响较大，其发生往往隐匿且发展较为缓慢，及早诊断和治疗可以避免周围神经损伤带来的感觉和运动功能障碍的丢失。多年来对于周围神经慢性卡压损伤的众多研究主要集中于卡压神经局部组织和支配骨骼肌的病理机制研究，以往研究报道坐骨神经慢性卡压损伤可致卡压神经局部组织和支配骨骼肌形成纤维化[4,5]。2019年3～12月，本研究探讨了坐骨神经慢性卡压损伤是否也可导致背根神经节纤维化的病理改变，并进一步探讨背根神经节细胞外基质过度沉积的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7～8周龄普通级SD雄性大鼠30只(三峡大学医学实验动物伦理委员会审批，伦理批准号2018030E)，体质量250～300 g，由三峡大学实验动物中心提供，按照普通级动物标准饲养和管理大鼠(自由进食饮水，每天交替进行12 h光照、12 h黑暗)。

1．2 实验试剂 蛋白抽提试剂盒(武汉拜意尔生物公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉拜意尔生物公司)，化学发光试剂盒(Millipore公司)，正常羊血清(博士德公司)，兔抗Collagen Ⅰ、TGF-β1多克隆抗体(SantaCruz公司)，p-ERK、p-JNK、p-p38多克隆抗体(CST公司)。

1．3 方法

1．3.1 大鼠坐骨神经卡压模型构建 取30只SD雄性大鼠，经腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，大鼠右侧大腿背侧皮肤备皮，消毒后沿右侧坐骨神经走形方向切开皮肤，充分显露右侧坐骨神经,将内径1 mm、长1 cm硅胶管剖开后，套在显露的右侧坐骨神经周围，8-0缝线缝合硅胶管切开处，将坐骨神经放回原处，逐层缝合伤口，设为卡压侧。按照同样方法暴露左侧坐骨神经后放回原处缝合伤口设为对照侧。

1．3.2 大鼠腓肠肌肌肉萎缩和纤维增生情况观察 造模3周和8周时，分别取10只SD雄性大鼠，经腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，用颈椎脱白法处死实验大鼠，分别切取大鼠卡压侧坐骨神经支配的腓肠肌样本及对照侧腓肠肌样本。腓肠肌经4%多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋，取腓肠肌肌腹中段处，横切3～4 μm厚的连续薄片。石蜡切片脱蜡至水，铁苏木素染色，酸性乙醇分化，氨水返蓝，丽春红品红染色，乙酸溶液洗，磷钼酸分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。Masson三色染色后胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。用ImageJ图像分析软件分别测量并计算腓肠肌横截面积(CSA)和胶原容积分数(CVF)，CSA和CVF分别用于反映大鼠坐骨神经卡压损伤后腓肠肌发生肌肉萎缩和纤维增生情况。

1．3.3 大鼠背根神经节Collagen Ⅰ、TGF-β1、p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白检测 ①造模3周时，取10只SD雄性大鼠，经腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，用颈椎脱白法处死实验大鼠。打开大鼠胸腔，暴露心脏，从左心室进针，剪开右心耳，同时向左心室内快速注入37 ℃生理盐水150 mL直至右心耳流出清亮液体，换4%多聚甲醛500 mL先快后慢注入左心室内，直到大鼠肺、肝变白变硬。大鼠背侧皮肤备皮，消毒后切开大鼠背侧皮肤，充分暴露脊柱，咬除脊柱棘突、横突等，打开髓腔暴露椎管内脊髓，牵出脊髓，用显微镊分别将双侧L4～6背根神经节从椎间孔中牵出，见梭形膨大的背根神经节，沿膨大边缘截取背根神经节。②将上述背根神经节剪成细小碎片，按每20 mg加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液匀浆直至完全裂解，提取背根神经节组织总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度后，将30 μg蛋白加样在含0.1% SDS的12%聚丙烯酰胺凝胶上，电泳2.5 h后分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5%脱脂奶粉室温封闭1 h，洗膜后加入抗体[内参GAPDH(1∶10 000)、Collagen Ⅰ(1∶5 000)、TGF-β1(1∶500)、p-ERK(1∶1 000)、p-JNK(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)]4 ℃摇床孵育过夜，抗目的蛋白抗体检测。洗膜后用过氧化物酶缀合的二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，加入ECL显色液，最后放入X线片夹中曝光、显影、定影，将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析，将目标带/内参灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2．1 大鼠卡压侧、对照侧腓肠肌CSA、CVF水平比较 造模3周时，卡压侧未见腓肠肌萎缩，但8周时可见腓肠肌萎缩。卡压侧、对照侧造模3周后腓肠肌CSA分别为(1 225 288±43 570)、(1 248 091±50 846)μm2，造模8周后分别为(797 525±25 846)、(1 239 353±50 846)μm2，两侧造模8周时相比P<0.05。造模3、8周时，卡压侧均可观察到腓肠肌胶原纤维增生。卡压侧、对照侧造模3周后腓肠肌CVF分别为(15.1±2.1)%、(2.1±0.6)%，造模8周后分别为(21.3±2.2)%、(2.2±0.7)%，两侧造模3、8周时相比P均<0.05。

2．2 大鼠卡压侧、对照侧背根神经节Collagen Ⅰ、TGF-β1、p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白表达比较 见表1。

表1 大鼠卡压侧、对照侧背根神经节蛋白相对表达量比较

3 讨论

尽管周围神经慢性卡压损伤的病例普遍存在，但是想要特征性描述周围神经慢性卡压损伤后的病理改变却十分困难，有限的人体标本数量限制了进一步研究周围神经慢性卡压损伤后的病理机制。本研究采用了Mackinnon设计的大鼠坐骨神经慢性卡压模型，该模型可以很好地模拟人类慢性神经卡压损伤后神经组织的病理改变[1,6]。本实验经过坐骨神经支配的腓肠肌Masson染色分析发现，坐骨神经卡压损伤3周后坐骨神经支配的腓肠肌内可观察到胶原纤维增生，坐骨神经卡压损伤8周后腓肠肌内可同时观察到骨骼肌萎缩和胶原纤维增生。既往研究报道，周围运动神经损伤后支配的骨骼肌肌肉组织将发生一系列的变化，在形态学上最主要的表现为肌间隙纤维胶原结缔组织增生导致的骨骼肌纤维化和骨骼肌失神经肌萎缩[5]。因此本实验观察到的结果可以很好地验证坐骨神经慢性卡压动物模型的可靠性和实用性，并且为下一步的研究提供良好的基础。

既往研究发现，神经卡压损伤信号可以逆行向上影响背根神经节内神经元形态、表型及其功能[7,8]，据此笔者猜测坐骨神经慢性卡压损伤后背根神经节可能同样会发生某些其他改变。以胶原纤维蛋白为主的细胞外基质合成与降解失衡调节着细胞外基质的代谢，胶原纤维蛋白也是纤维化的重要标志物，尤其是Collagen Ⅰ的异常累积可致组织纤维化，且Collagen Ⅰ在周围神经组成中占胶原纤维的80%以上[9]。本研究发现大鼠坐骨神经卡压损伤后卡压侧较对照侧背根神经节内Collagen Ⅰ表达升高，说明坐骨神经慢性卡压损伤可以引起背根神经节细胞外基质沉积和纤维化形成。

TGF-β1作为公认的强致组织纤维化的细胞因子之一，参与了肾脏、肝脏、肺、心脏等器官的纤维化进程[10]。TGF-β1与其受体结合，与Smad2、Smad3和Smad4形成复合物，该复合体从细胞质转移到细胞核，并调节各种靶基因表达，在成纤维细胞激活、细胞外基质沉积过程中起重要作用[11]。本研究发现卡压侧较对照侧背根神经节内TGF-β1表达升高，推测坐骨神经慢性卡压损伤后背根神经节细胞外基质沉积可能与背根神经节内TGF-β1表达升高有关。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是大多数真核细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是将细胞外信号转导到细胞核内，从而引起一系列生物学效应的重要信号传导系统[12]。它在调控细胞生长、发育、分裂及细胞间功能的同步性等多种生理功能中起重要作用，同样在成纤维化细胞增殖分化和组织纤维化的病理状况下也发挥重要作用[13]。此外，MAPK通路可与TGF-β1/Smad信号通路交互调节细胞内Smad分子活性，间接影响纤维化发生发展[14, 15]。本研究发现卡压侧较对照侧背根神经节内p-ERK蛋白表达升高，三级级联反应蛋白激酶Raf/MEK/ERK1/2信号通路能够将信号从膜传递到细胞内能够调节多种炎性介质及细胞因子的表达，在成纤维细胞增生和细胞外基质沉积中起着关键作用[16]。推测背根神经节内成纤维细胞ERK1/2信号通路在坐骨神经慢性卡压损伤后背根神经节细胞外基质过度沉积和纤维化过程中发挥重要调节作用，背根神经节内TGF-β1与ERK1/2交互调节共同影响坐骨神经慢性卡压损伤后背根神经节纤维化形成。同时本研究发现，卡压侧背根神经节内p-JNK、p-p38蛋白较对照侧表达降低。虽然既往研究发现，在成纤维细胞中，活化的JNK和p38信号通路的磷酸化水平升高参与了组织纤维化进程[17,18]，但是活化的ERK、p38和JNK在不同的细胞类型中可能通过不同的途径发挥作用，在相同类型的细胞中，这三者在细胞周期等其他方面的功能也可能存在不同[19]。

综上可见，大鼠坐骨神经慢性卡压损伤可以引起背根神经节内Collagen Ⅰ上调，可能与背根神经元内TGF-β1表达升高有关，并且可能通过ERK信号通路激活参与背根神经节内细胞外基质沉积和纤维化。因此，详细了解其涉及的分子生物学机制将可能为该类周围神经慢性损伤后改善感觉神经元功能提供新的治疗方向。