于启蒙，张新超，孟慧琴，张 霖，朱德志，章 伟，王爱东

（黄山学院，黄山 2544041）

1 前言

白术（Rhizoma atractylodis macrocephalae）为菊科植物，根状茎为拳头大小且形似如意，表面有瘤状突起和根须，干燥根茎为表面灰黄或灰棕色的不规则的肥厚团块[1]。《神农本草经》中最先载录白术：“术，味苦温。主风寒湿痹，死肌，痉，痘，止汗，除热，消食，作煎饵，久服，轻身延年，不饥。一名山蓟。生山谷。”[2]。白术具有潜在的抗多种肿瘤、抗SARSCoV、抗炎杀菌、抗神经系统疾病，治疗糖尿病、心血管疾病、免疫系统和消化系统疾病的药效作用[3-6]。在2019年底爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19，SARS-CoV-2）药物治疗方案中，官方共纳入18种中药方剂供新冠肺炎的预防和治疗，其中白术多次被用到[7]。白术主要含有挥发油类成分，其中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[8]，苍术酮、β-榄香烯、香橙烯和异香橙烯[9]是挥发油的主要成分，也是白术的主要活性成分。

本文使用DS 软件中的反向找靶功能模块寻找由白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮、β-榄香烯、香橙烯和异香橙烯组成的配体分子库的潜在作用靶点蛋白；然后利用DS 软件中的分子对接功能模块查看分子库中7个分子与契合值（Fit value）≥0.9，且对应打分最高的靶点蛋白的非键相互作用情况，并预测各分子的药效机理，为中药白术的实验研究、疾病治疗和新药研发提供科学的理论依据。

2 材料和方法

2.1 配体分子库准备

利用软件BIOVIA Draw 2016 构建白术挥发油的主要成分2D 平面结构：白术内酯Ⅰ（Butenolide Ⅰ）、白术内酯Ⅱ（Butenolide Ⅱ）、白术内酯Ⅲ（Butenolide Ⅲ）、苍术 酮（Atractylone）、β- 榄香烯（β-Elemene）、 香橙 烯（Aromadendrene）和异香橙烯（Allo-aromadendrene），结构式如图1为所示。将其保存为mol 文件，然后导入到DS 计算机辅助药物设计软件中呈现为3D 空间构象；最后进行分子结构优化，保存为dsv 文件。

2.2 反向找靶计算

用DS 打开优化后的分子库文件，打开Ligand profiler 参数浏览器，设置参数：①输入配体；②展开药效团输入栏，在是/否添加形状束缚的搜索限制中选择“All”，在是/否进行全库搜索中选择“All Models”；③展开高级设置组，设置Save Aligned Ligands 为True；④在是/否进行平行运算中选择“True”；⑤其余保持默认，点击“Run”运行。

图1 白术挥发油的主要成分分子结构式

2.3 分子对接计算

2.3.1 靶点蛋白准备

根据表1 中的PDB ID 从Protein Data Bank（PDB）数据库中下载蛋白质文件。利用DS 对蛋白质预处理，删除蛋白质结构中的水分子、杂原子和自身结构解析时所携带的金属离子或溶剂残留分子；最后对蛋白质结构进行优化后保存为dsv文件。

表1 配体分子和靶点蛋白信息表

2.3.2 分子对接操作

本 文 采 用Discovery Studio 2016 软 件CDOCKER 中 的Dock Ligands（Pharmacophore Restraints and CHARMm）进行对接运算。打开对接参数浏览器设置参数：①输入受体蛋白；②输入配体分子；③输入药效团；④在是/否进行平行运算中选择“True”；⑤其余保持默认，点击“Run”运行。

3 结果与讨论

3.1 反向找靶结果

（1）反向找靶运行完成后，打开结果报道页面，点击Fits Organized by Molecule 链接，查看配体分子与靶标药效团的契合值（Fit value），筛选出与靶标药效团的Fit value ≥0.9的配体分子和各配体分子对应打分最高的靶点蛋白（见表1）。

（2）筛选出与配体分子的Fit value ≥0.8 的靶标药效团，利用生物信息分析热图聚类分析软件HemI 1.0做配体分子与对应的各靶标药效团的Fit value 值的热图。横坐标为各靶标药效团模型，纵坐标为配体分子；图中右侧的标尺颜色为渐变色，从蓝色至红色逐渐过渡，表示Fit value 值从“0.800”逐级递增。Fit value 值越大，表示小分子与靶标蛋白契合得越好，说明对应的蛋白是小分子潜在作用的靶点的可能性高。热图结果如图2所示。

图2 配体分子与靶标药效团契合值（Fit value）的热图

3.2 分子对接结果和药效预测

分子对接计算运行完成后，通过DS 的Receptor-Ligand Interactions 模块查看配体分子与受体残基的非键相互作用情况，结合National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库对靶点蛋白的信息介绍预测配体分子进行药效。

（1）2OXX 是 蛋 白 激 酶—酪 蛋 白 激 酶2 或II（casein kinase，CK2）。CK2是高度多效性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在特定情况下能够促进细胞存活并增强肿瘤表型[10]。CK2调控许多细胞功能，目前它是研究癌症的目标。图3～图4分别为白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅱ与2OXX 相互作用图。

图3 白术内酯Ⅰ与2OXX相互作用图（上左3D前，上右3D后，下2D）

图4 白术内酯Ⅱ与2OXX相互作用图（上左3D前，上右3D后，下2D）

白术内酯Ⅰ与2OXX 通过氢键、烃基和π-烷基键相互作用；白术内酯Ⅱ与2OXX 通过π-硫键、烃基和π-烷基键相互作用；预测白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅱ分子与CK2结合相互作用，能够抑制其活性，具有潜在的抗癌药效作用。

（2）3LBJ 是MDMX 蛋白（murine double minute X，又称为MDM4）。MdmX 过表达通过抑制肿瘤抑制因子p53促进癌症的发展，抑制因子p53在细胞周期阻滞、DNA 损伤修复及细胞凋亡等生物过程发挥重要作用，并成为肿瘤治疗靶点[11]。图5为白术内酯Ⅲ与3LBJ 相互作用图。

图5 白术内酯Ⅲ与3LBJ相互作用图（左3D，右2D）

白术内酯Ⅲ与3LBJ通过氢键、烃基和π-烷基键相互作用；预测白术内酯Ⅲ分子可成为MDMX 蛋白的抑制剂，为治疗恶性肿瘤带来新方向。

（3）3A51是维生素D3羟化酶（Vitamin D3hydroxylase，Vdh）。Vdh 是一种细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶，能催化维生素D3（VD3）特定位点羟基化反应，产生活性衍生物[12]。VD3调节靶细胞的增值、分化或功能，与肿瘤发生、免疫调节、抗炎效应等相关[13]。图6为苍术酮与3A51相互作用图。

图6 苍术酮与3A51相互作用图（左3D，右2D）

苍术酮与3A51通过烃基和π-烷基键相互作用；预测苍术酮分子可增强维生素D3羟化酶活性，有潜在的抗肿瘤、抗炎和免疫调节药效。

（4）1P5E 是细胞周期蛋白A（Cyclin A）和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2（cyclin-dependent protein kinase2，CDK2）的复合物（Cyclin A-CDK2）。Cyclin A-CDK2活性异常上调是肿瘤细胞重要的生物学特征，在一些癌细胞中，频繁检测到极度活跃的Cyclin A-CDK2活性，Cyclin A-CDK2已经成为治疗癌症的重要靶标[14]。图7为β-榄香烯与1P5E 相互作用图。

图7 β-榄香烯与1P5E相互作用图（左3D，右2D）

β-榄香烯与1P5E通过烃基和π-烷基键相互作用；预测β-榄香烯分子可以作用于活性异常的Cyclin A-CDK2，成为研究抗癌的新药物。

（5）2WU7 是双特异性蛋白激酶（dual specificity protein kinase，DSK）家族的CDC 样激酶3（cell division cycle like kinase 3，CLK3），CLK 激酶是蛋白质剪接的关键调节因子，通过磷酸化剪接因子上的富含丝氨酸和精氨酸（SR）的结构域，调节蛋白质的剪接[15]。DSK 可能与细胞癌变、细胞周期调控和细胞生长等有关[16]。图8为香橙烯与2WU7相互作用图。

图8 香橙烯与2WU7相互作用图（上左3D前，上右3D后，下2D）

香橙烯与2WU7通过烃基和π-烷基键相互作用；预测异香橙烯分子与CLK3相互作用，可开发为靶向蛋白剪接的抑制剂，调控细胞生长并有可能具有潜在的抗癌药理作用。

（6）3KXN 是酪蛋白激酶2α 亚基（casein kinase 2α，Ck2α）。蛋白激酶Ck2α 是丝氨酸/苏氨酸激酶CK2催化亚基的一种亚型，研究发现，CK2α 基因可能是原癌基因，在细胞中过度表达可引起癌变，并且CK2α 在增殖和肿瘤细胞中活性较正常细胞明显升高，能参与包括肝细胞癌（HCC）在内的各种恶性肿瘤的发生[17]。图9为异香橙烯与3KXN 相互作用图。

图9 异香橙烯与3KXN相互作用图（左3D，右2D）

异香橙烯与3KXN 通过烃基相互作用；预测异香橙烯可抑制CK2α 激酶活性，阻止肝细胞癌等恶性肿瘤的发生。

4 结论

本文通过反向找靶技术，在含有药效团模型的靶标库中搜寻，得到白术挥发油的主要成分契合度fitvalue 值大于0.9的靶标蛋白，然后利用分子对接查看配体-受体间的非键相互作用，最后查阅靶点蛋白的生理功能，预测白术主要成分药效。结果表明白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮、β-榄香烯、香橙烯和异香橙烯分子7种成分均与抗癌或抗肿瘤靶标蛋白有相互作用，其中苍术酮还与兼有抗炎和免疫调节靶标蛋白有相互作用。其中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅱ作用于酪蛋白激酶2，白术内酯Ⅲ作用于MDMX 蛋白，苍术酮作用于维生素D3羟化酶，β-榄香烯作用于细胞周期蛋白A 和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2的复合物，香橙烯作用于CDC样激酶3，异香橙烯作用于酪蛋白激酶2α亚基。综上，白术挥发油的主要成分主要具有抗肿瘤、免疫调节和抗炎的药效，为白术在治疗疾病方面的研究提供了理论依据。

致谢：感谢全国大学生创新创业训练计划项目资助（中压制备色谱快速制备莪术有效成分研究，项目编号：201810375043；黄山地道中药祁术主要成分作用靶点及作用机理，项目编号：201810375113）。感谢黄山学院校级科研平台药物设计重点实验室（kypt201810）。