洪 勇，周民伟，徐化交

0 引 言

化疗是胃癌最常用的治疗方法，但5-氟尿嘧啶、顺铂、阿霉素等多数化疗药物疗效不满意，不良反应严重[1-2]。因此，迫切需要寻找新效药物以提高胃癌的治疗效果。研究发现，罗哌卡因具有影响人癌细胞侵袭的能力[3]。在直结肠癌细胞中，罗哌卡因通过抑制基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和MMP-9的表达，在体外抑制细胞的侵袭和迁移[4]。此外，持续输注罗哌卡因还可抑制小鼠骨肉瘤LM8细胞的肺转移[5]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途径在癌症化疗中的作用受到研究者的关注。PKC在肿瘤增殖和生存过程中发挥作用，它也被认为具有致癌活性[6]。原癌基因(proto-oncogene，c-MYC)是PKC通路的下游靶基因之一，参与细胞周期进展、细胞生长、分化、代谢和凋亡的基因的主要调控因子，也是一种有效的细胞致癌基因，在人类癌症中经常发现其异常[7]。因此，在本研究探讨罗哌卡因对胃癌MGC-803细胞增殖、迁移的影响，并探讨其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器主要试剂：罗哌卡因(瑞典AstraZeneca AB公司，批号:6903065.77)；顺铂(美国sigma公司，批号：P4394)；人胃癌MGC-803细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；RPMI-1640培养基和胎牛血清(美国HyClone公司)；青链霉素溶液(美国Corning公司)；细胞计数试剂盒8 (cell count kit 8，CCK-8)(美国Amresco公司，规格：96T)；细胞蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所)；PKC、c-MYC、MMP-9、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target of rapamycin，mTOR)和β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG二抗(武汉艾美捷科技有限公司)。主要仪器：Multiskall MK3酶标仪(美国Thermo scientific公司)；CO2培养箱(美国Ther-mo Revco公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；BD垂直电泳仪(美国BD公司)；凝胶成像仪(美国UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组用含胎牛血清(10%)和50 U/mL青链霉素(50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素)的RPMI-1640培养液在37 ℃、5%CO2条件下培养MGC-803细胞，选择对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因中剂量组、罗哌卡因高剂量组和顺铂组。对照组无处理，罗哌卡因低、中、高剂量组分别给予终浓度为100、200、400 μg/mL的罗哌卡因[8]，顺铂组给予终浓度为10 mmol/mL的顺铂[9]，继续培养24 h后进行相关检测。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖率以5×103/孔接种于96孔板中(200 μL/孔)，待细胞融合后，按1.2.1给予受试物干预20 h，继续培养20 h，向培养板中加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃继续培养4 h，用酶标仪在630 nm处测定吸光度值，细胞增殖率计算公式如下：

细胞增殖率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)

1.2.3 细胞划痕法检测MGC-803细胞迁移能力以5×104/孔接种于6孔板中(2 mL/孔)，待细胞融合，用100 μL灭菌枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用无血清的RPMI-1640培养基清洗3次，按1.2.1给予受试物干预24 h后，用显微镜下拍照，用图像分析仪测量测量划痕宽度。

1.2.4 Western blot法检测PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表达以5×104/孔接种于6孔板内(3 mL/孔)，待细胞融合加入按1.2.1分组分别处理MGC-803细胞24 h，收获细胞，根据细胞量加入细胞蛋白抽提液，进行电泳(每孔上样量为20 μg)，将印迹转移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1 h，将膜与PKC(1∶200)、c-MYC(1∶100)、MMP-9(1∶400)、PI3K(1∶300)、AKT(1∶400)、mTOR(1∶200)和β-actin(1∶1000)抗体进行孵育，4 ℃过夜，用TBST缓冲液对膜进行2次冲洗，将二抗(1∶5000)在室温下孵育30 min。进行显色，采集图像进行分析。

2 结 果

2.1 罗哌卡因对MGC-803细胞增殖和迁移能力的影响与对照组比较，各罗哌卡因剂量组和顺铂组MGC-803细胞增殖率和迁移能力降低，且各罗哌卡因剂量组降低强度呈剂量依赖性，但细胞增殖率和迁移能力仍高于顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1、图2。

表1 罗哌卡因对MGC-803细胞增殖和迁移能力的影响

a:对照组;b-d:分别为罗哌卡因低剂量、中剂量、高剂量组;e:顺铂组图示随着罗哌卡因剂量的增加，细胞增殖率降低图1 罗哌卡因对MGC-803细胞增殖影响的透射电镜图( ×3000)

a:对照组;b-d:分别为罗哌卡因低剂量、中剂量、高剂量组;e:顺铂组图示随着罗哌卡因剂量的增加，细胞迁移能力降低图2 罗哌卡因对MGC-803细胞迁移能力影响的划痕实验结果( ×200)

2.2 罗哌卡因对MGC-803细胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表达的影响与对照组比较，各罗哌卡因剂量组和顺铂组MGC-803细胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表达均降低，且各罗哌卡因剂量组降低强度呈剂量依赖性，但各指标表达仍高于顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图3。

表2 罗哌卡因对MGC-803细胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表达的影响

1:对照组;2-4分别为：罗哌卡因低剂量、中剂量、高剂量组;5:顺铂组图3 罗哌卡因对MGC-803细胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表达影响的电泳图

3 讨 论

既往大量报道显示，罗哌卡因对癌症具有一定的治疗作用，且其安全性令人满意[10]。为了进一步了解罗哌卡因对胃癌的分子机制，本研究进行了一系列的体外实验。通过CCK-8检测结果可以看出，罗哌卡因对胃癌MGC-803细胞有生长抑制作用。

转移是癌症的标志之一，抑制转移已成为治疗癌症的有吸引力的治疗选择。 在转移中，细胞迁移是关键步骤。最近的报告显示，罗哌卡因既可以起到抗肿瘤作用，又可以起到抗血管生成作用[11]。有研究显示，罗哌卡因降低了人纤维肉瘤HT-1080细胞中MMP-9的水平[12]。本研究结果表明，罗哌卡因抑制人胃癌细胞的迁移，并与抑制MMP-9的表达有关，从而扩大了罗哌卡因的生物活性。在此，本研究证实了罗哌卡因通过c-MYC信号通路在体外抑制细胞的增殖和迁移。

罗哌卡因除了体外抑制细胞的增殖和迁移，本研究发现罗哌卡因降低了PKC水平。这些数据表明，PKC是罗哌卡因的抗肿瘤作用的主要关键目标。为了进一步验证这一假设，本研究检测了c-MYC水平的变化。原癌基因PKC的致癌途径与下游c-MYC表达增加相关联[13]。c-MYC是人类癌症中最普遍的致癌基因之一，在约50%的肿瘤中被失调，尤其是在淋巴瘤中，并且还存在于子宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌中[14]。尽管有一些研究报道c-MYC的阳性表达与不良预后显着相关，如食管鳞状细胞癌样品中存在c-MYC过表达，并且c-MYC mRNA的水平是淋巴结转移的危险因素，是食管鳞状细胞癌患者生存的指标，但其潜在机制尚未得到很好的了解[15]。研究显示，c-MYC是细胞生长的重要调控因子，并在多种细胞类型中响应生长促进因子而被激活[16]。癌基因表达的变化在细胞癌变和逆转运动中起重要作用，相关基因的扩增和失活是人胃癌细胞的主要指标。因此，c-MYC基因表达的改变是细胞转化和增殖的重要事件。PI3K/Akt/mTOR信号转导通路由PI3K、Akt和mTOR三个蛋白酶组成。PI3K/Akt/mTOR信号转导通路的激活可通过多种刺激抑制凋亡的触发，促进肿瘤细胞的周期进展、存活和增殖[17]。此外，PI3K/Akt/mTOR信号通路还具有多种功能，包括参与血管生成、恶性肿瘤的发生、发展和耐药，以及肿瘤的侵袭转移[18]。研究显示，罗哌卡因通过PI3K/Akt/mTOR诱导人脐血管内皮细胞自噬并抑制血管生成能力，而过表达c-MYC可显著增加黑色素瘤B16F10细胞中mTOR蛋白的表达[19]。在本研究中，我们发现罗哌卡因的加入明显抑制了c-MYC的表达，从而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。因此，c-MYC可能成为胃癌治疗的新靶点。

综上所述，本研究显示罗哌卡因通过抑制c-MYC信号通路在体外抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和迁移。这些结果突出了罗哌卡因作为抗增殖和抗迁移剂的重要性，并可能提供抗胃癌的治疗潜力，但其作为临床治疗药物还要大量的研究进行论证。