刘胜芳 何德根 陈钊扬 欧彩香

新生儿肺部感染临床中较为常见，该病无典型症状，严重可导致患儿死亡[1]。新生儿时期是儿童发生肺炎后死亡的最高危险阶段，新生儿疾病的早期防御于其固有免疫状态密切相关。自然杀伤细胞在体内的功能主要包括消灭“非己”细胞以及对病原微生物感染进行清除，在感染的早期免疫反应过程中扮演重要角色[2,3]。机体免疫功能的主要细胞群除自然杀伤细胞外还包括淋巴细胞，在免疫调节过程中，淋巴细胞亚群的比例以及数量均处于一种动态平衡的状态下，各亚群通过彼此间的相互作用使机体的免疫功能发挥正常[4-6]。本研究以新生儿细菌感染性肺炎患者为研究对象，分析其外周血自然杀伤细胞及T淋巴细胞亚群水平的变化，探讨新生儿细菌感染性肺炎的免疫机制，并分析其表达水平与病程进展之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2017年12月我院收治的92例新生儿细菌感染性肺炎患者以及30例同期于我院娩出的健康新生儿为研究对象。检测新生儿细菌感染性肺炎患者外周血白细胞的数量，根据检测结果将其分为轻度感染组(5.0×109/L<外周血白细胞<20.0×109/L，n=58)与重度感染组(外周血白细胞<5.0×109/L或>20.0×109/L，n=34)，健康新生儿作为正常对照组(n=30)。3组受试者性别比、出生孕周、出生体重、出生天数比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准，且受试者均已签署书面知情同意书。见表1。

表1 3组治疗前基线资料比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合诊断标准的细菌性肺炎；②足月产新生儿；③临床资料完整者。

1.2.2 排除标准：①吸入性肺炎者；②肺透明膜病者；③细菌学培养阴性者；④合并恶性肿瘤患者；⑤自身免疫性疾病。

1.3 观察指标

1.3.1 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定3组降钙素原、C-反应蛋白含量：ELISA试剂盒购自上海抚生实业有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.2 采用流式细胞仪测定3组外周血自然杀伤细胞及其细胞亚群含量：全部受试者取1 ml外周血，以肝素钠进行抗凝，室温条件下4 h内测定；总自然杀伤细胞及CD3-CD56negCD16bright，CD3-CD56dimCD16bright，CD3-CD56brightCD16neg/dim等细胞亚群占外周血淋巴细胞的百分比采用全血直接免疫荧光染色法进行测定。

1.3.4 采用ELISA法测定3组IgA、IgG、IgM等免疫球蛋白含量：全部受试者取1 ml外周血，以肝素钠进行抗凝，离心后取上层血清，ELISA试剂盒购自上海抚生实业有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.5 采用流式细胞仪测定3组IL-4、IFN-γ等特征性细胞因子含量：向流式细胞仪专用试管中依次加入RPMI1640 500 μl、1 μg/ml的PMA5 μl、1 μg/ml的离子霉素1 μl、10 μg/ml的BFA 1 μl、外周血500 μl；采用涡旋混匀器进行混匀，置于37℃，5% CO2的条件下培养5 h；IFN-γ/IL-4抗体管及对照管中分别加入外周血200 μl、洗涤液1 ml，低速混匀，置于4℃条件下避光静置30 min，采用低温高速离心机以1 500 r/min的转速离心5 min，下层残留液保留50 μl左右；加入洗涤液1 ml，采用低温高速离心机以1 500 r/min的转速离心5 min，取下层残留液备用；试管中加入CD4-APC 5 μl，并相应加入10 μl小鼠抗人IFN-γ/IL-4，混匀后于4℃条件下避光静置30 min；洗涤、离心，取下层残留液50 μl，加入PBS 400 μl，混匀后上机测定。

2 结果

2.1 3组受试者血清降钙素原、C-反应蛋白比较 正常对照组血清降钙素原、C-反应蛋白表达水平明显低于轻度感染组和重度感染组患者，轻度感染组患者明显低于重度感染组，3组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组受试者血清降钙素原、C-反应蛋白比较

2.2 3组受试者外周血自然杀伤细胞亚群表达水平比较 正常对照组外周血自然杀伤细胞及亚群CD3-CD56negCD16bright、CD3-CD56dimCD16bright、CD3-CD56brightCD16neg/dim表达水平明显高于高于轻度感染组和重度感染组，轻度感染组明显高于重度感染组，3组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组受试者外周血自然杀伤细胞亚群表达水平比较

表4 3组受试者T淋巴细胞亚群含量比较比较

2.4 3组受试者免疫球蛋白含量比较 正常对照组IgM含量明显低于轻度感染组和重度感染组，轻度感染组明显低于重度感染组，3组受试者间差异均有统计学意义(P<0.05)；3组受试者间IgA、IgG含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 3组受试者免疫球蛋白含量比较

2.5 3组受试者特征性细胞因子水平比较 正常对照组IL-4表达水平明显低于轻度感染组和重度感染组，轻度感染组明显低于重度感染组，3组间差异有统计学意义(P<0.05)；3组间IFN-γ表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 3组受试者特征性细胞因子水平比较

3 讨论

机体免疫细胞包括适应性免疫细胞以及天然免疫细胞，天然免疫细胞也被称为固有免疫细胞，主要包括单核细胞、粒细胞、树突状细胞以及自然杀伤细胞等。活化的自然杀伤细胞可通过分泌一系列细胞因子从而对机体免疫进行调节。自然杀伤细胞属于非特异性免疫系统的重要组成成分，主要表达CD56以及CD16分子[7,8]。故而，本研究选择自然杀伤细胞及其三种主要细胞亚群进行了检测，结果显示，新生儿细菌感染性肺炎患儿外周血自然杀伤细胞及CD3-CD56negCD16bright，CD3-CD56dimCD16bright，CD3-CD56brightCD16neg/dim细胞亚群水平均较健康新生儿显著降低，且患儿感染程度越严重则自然杀伤细胞及其细胞亚群含量越低，由此可以推断，新生儿细菌感染性肺炎患儿外周血自然杀伤细胞数量存在缺陷，且细胞数量与感染严重程度呈正相关，与相关文献报道[9-11]相一致。此外，免疫球蛋白检测结果显示，新生儿细菌感染性肺炎患儿IgM水平明显高于健康新生儿，且重度感染患儿IgM水平更高，而3组IgA、IgG含量差异无统计学意义(P>0.05)，分析原因是由于IgG主要源自母体，IgM、IgA却无法通过胎盘传送，因此新生儿出生后时IgM、IgA水平较低，IgM合成迅速于生后2～5 d上升，而IgA含量则在生后几周才开始上升，故而低水平的IgM使得补体水平过低无法完整发挥生物学功能，最终增加肺炎等感染性疾病易感性。研究人员通过动物模型发现，自然杀伤细胞产生的IFN-γ可对嗜肺性军团病杆菌进行有效清除；另有研究指出，脓毒症患者的抵抗病原体的作用是通过自然杀伤细胞产生的IFN-γ实现的[12,13]。本研究中，新生儿细菌感染性肺炎患儿IL-4表达水平明显高于健康新生儿，且重度感染组患儿IL-4表达水平明显高于低于重度感染组(P<0.05)，但3组间IFN-γ表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

研究证实，固有免疫反应可通过T淋巴细胞与B淋巴细胞之间的相互作用以产生记忆性应答或疫苗，从而避免感染发生[14-16]。有研究指出，获得性免疫应答分包括分别由T细胞、B细胞介导的细胞免疫应答以及体液免疫应答[15-18]。T淋巴细胞亚群在机体细胞免疫扮演重要角色，成熟T细胞以CD3+T淋巴细胞为代表，其表达水平降低与免疫功能下降相关；CD4+T淋巴细胞可对B淋巴细胞产生抗体的过程进行刺激，其表达水平降低与淋巴细胞因子数量降低相关；CD8+T淋巴细胞会对B淋巴细胞产生抗体过程进行抑制，其水平较低可说明机体免疫抑制功能被削弱[17-21]。本研究结果显示，新生儿细菌感染性肺炎患儿CD4+表达水平明显低于健康新生儿、CD19+表达水平明显高于健康新生儿，且此种差异在重度感染患儿中更为明显，再次证实新生儿细菌感染性肺炎患儿存在免疫功能紊乱，其B淋巴细胞与T淋巴细胞亚群均发生异常。

综上所述，新生儿细菌感染性肺炎患者外周血自然杀伤细胞及淋巴细胞亚群表达水平异常，且异常程度与病程进展相关，临床中可通过检测自然杀伤细胞及淋巴细胞亚群水平，评估新生儿细菌感染性肺炎患者疾病严重程度，选择合适的治疗方式，促进患者疾病康复。