郏乐铭 贾小玥 杨燃 周学东 徐欣

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041；

2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院儿童口腔科 成都 610041

人体表面和体内定植着超过100万亿的共生微生物，它们在人类健康和疾病中发挥着重要的作用。口腔作为人体五大菌库（口腔、肠道、皮肤、鼻腔和阴道）之一，是一个完整复杂的微生态系统[1]。定植于人口腔中的微生物包含需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌，以及螺旋体、真菌、古细菌、支原体、病毒和原虫等其他微生物[2]，在口腔不同位置共栖、竞争和拮抗，与口腔固有环境共同组成了口腔微生态系统。正常生理状态下，口腔微生物之间、微生物与宿主之间存在着动态平衡，共同参与宿主代谢、免疫和营养过程，维护口腔健康。在外环境与宿主因素的影响下，口腔微生态平衡被破坏，口腔常驻菌条件致病进而导致多种口腔疾病（如龋病、牙周病、牙髓根尖周病、口臭、口腔念珠菌病等）的发生[3]。

牙周病是发生于牙齿支持组织的细菌感染性疾病，主要表现为牙龈的炎症和出血、牙周附着丧失、牙槽骨吸收，导致牙松动、移位、脱落。牙周病的发生发展与牙周微生态失衡及宿主的免疫调节反应息息相关。牙周病的基础治疗方法主要是依靠机械方法去除菌斑生物膜，并常常辅以局部或全身用药，但牙周致病菌的频繁定植和口腔耐药菌的出现对常规牙周病治疗方法提出了挑战。

益生菌一般来源于正常微生物菌群，可调节口腔局部生态平衡，改善全身免疫状况，常用于调节胃肠道微生态紊乱。在牙周病治疗中，益生菌可作为一种替代性、补充性的生物制剂，通过调节牙周菌斑代谢，控制牙周病进展。

1 牙周病与牙周微生态

牙周病是一种与微生物相关、宿主介导并导致牙周附着丧失的炎症。牙周病对人体危害极大，是中老年人失牙的主要原因。早在1986年，Theilade[4]就提出了牙周病菌群失调学说，1994年Marsh[5]提出了生态菌斑假说，认为牙周病并非某种特定的微生物感染导致，而是与口腔微生态失衡有关。近年来，随着分子生物学技术的发展与微生态学研究的深入，在牙周炎发生部位已检出超过400种细菌[1]。目前学者们普遍认为，与牙周病发生发展关系最为密切的细菌群落为红色复合体，包括牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体；除红色复合体之外，橙色复合体（包括普雷沃菌属、具核梭杆菌属、弯曲菌属、直杆菌属）在疾病和活动性牙周病灶部位的检出量较健康部位更高，与牙周袋深度和探诊出血紧密相关[6]。不同类型的牙周病患者检出的微生物种类有所差异。难治性牙周炎患者可以特异性检出缺陷短波单胞菌、毗邻颗粒链菌、非典型韦荣菌和鲍曼不动杆菌，后者具有耐药性，是难治性牙周炎的危险因素[7]。在侵袭性牙周炎患者，溶杆菌、微小微单胞菌、二氧化碳嗜纤维菌的检出丰度显著高于其他类型牙周炎[8-9]。严重牙周炎患者（牙周袋深超过6 mm）中，氨基酸球菌科的硒单胞球菌属及巨型球菌属是主要优势菌[10]，产线菌属、毛螺菌属、消化链球菌属、丹毒丝菌属、溶杆菌属的检出率也相应上升。牙周微生态还可为牙周病治疗的评估提供相关参考，Lu等[11]通过比较牙周基础治疗后3个月内龈下微生物的变化情况，对采用超声和甘氨酸喷砂两种基础治疗方法治疗牙周病的有效性进行评估，结果发现，治疗后龈下微生物的丰度和多样性明显降低，一些牙周致病微生物（包括密螺旋体属和拟杆菌属）明显下降，而一些牙周共生菌如链球菌属则明显上升。此外，该研究还发现，在治疗后3个月，牙周微生物的相对丰度基本恢复到了治疗前的基线水平，由此可知，在3个月的维护期内，牙周微生态可维持相对平衡。以上研究均提示，微生态失衡是导致牙周病发生发展的重要原因。口腔微生物可通过直接黏附、定植、入侵牙周组织，抑制或逃避宿主的防御功能，对牙周组织造成破坏，最终导致牙周病的发生发展[12-13]。

2 牙周病的生态治疗

2.1 牙周病的生态治疗概述

牙周病的治疗重点是清除和控制牙菌斑。目前主要的基础治疗方法包括龈上洁治术、龈下刮治术、根面平整术等，均是通过机械清除的方法去除牙菌斑；可以同时辅助使用药物，以清除入侵组织深处的细菌，调节局部及全身的免疫防御功能[2]。牙周致病菌的频繁定植和口腔耐药菌的出现，对常规牙周病基础治疗来说是非常不利的因素。为了克服这些不利因素，近年来微生态调节技术应运而生。该技术通过应用靶向性多肽、靶向小分子、中药提取物和多酚、噬菌体、益生菌等手段调节口腔局部生态平衡，并通过药物改善全身情况，从而逆转微生态失衡的状况[14]。益生菌作为一种替代性、补充性的生物制剂，可通过调节牙周菌斑代谢以控制牙周病进展，在牙周病防治中展现了较好的应用前景。

2.2 益生菌在牙周病防治中的应用

益生菌制剂种类繁多，其菌种主要来源于宿主正常菌群中的生理性优势细菌、非常驻的共生菌和生理性真菌三大类[15]。中国卫生健康委员会批准应用于保健食品的主要益生菌种类见表1[15]。

表1 中国卫生健康委员会批准应用于人体的益生菌分类Tab 1 Classification of probiotics for use in humans approved by National Health Commission of the People's Republic of China

目前用于辅助治疗口腔疾病的益生菌主要分为两大类。一类是首次分离自人体其他部位，后来发现也可从健康人群口腔中分离得到的益生菌菌种，如发酵乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等，已经被广泛应用于消化道疾病的治疗，其抗菌和抗炎效果已被证实。另一类是从口腔中分离出的特异性益生菌菌种，如唾液链球菌K12（Streptococcus salivariusK12）、唾液链球菌M18等[16]。以上两类益生菌均在口腔感染性疾病（如龋病、牙周病）的防治中有所应用，并取得了较好的临床疗效。但目前对食品微生物菌种（microbial food cultures，MFC）的申报要求不一，管理方式各异，暂无统一且相互认可的益生菌安全性评价方法体系[17]。因国内目前暂无口腔益生菌的详细管理指导，本文参考了联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）与世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的评估导则[18]，总结了目前已被完全或部分证实可应用于口腔感染性疾病防治的益生菌种类，见表2[19-26]。

Teughels等[27]的研究发现，中至重度牙周炎患者通过服用含有罗伊氏乳杆菌的含片辅助牙周基础治疗（龈下刮治及根面平整）12周后，与接受牙周基础治疗和安慰剂的对照组相比，探诊深度（probing depth，PD）和附着丧失（attachment loss，AL）程度明显好转。Shah等[28]比较牙周基础治疗与益生菌及抗生素辅助治疗牙周基础治疗的差异，发现单独使用含有短乳杆菌的片剂，单独使用抗生素或组合使用抗生素与短乳杆菌片剂辅助治疗的效果均优于只进行牙周基础治疗组，PD、牙龈指数（gingival index，GI）、菌斑指数（plaque index，PLI）、AL在治疗2个月后都有明显下降，且抗生素与益生菌制剂辅助治疗相比差异无统计学意义。Riccia等[29]直接应用含有短乳杆菌的益生菌制剂治疗未经过基础治疗的牙周病患者，发现使用该益生菌制剂后，牙周病患者的牙龈炎症程度和牙结石沉积程度明显降低；若初次就诊时牙龈炎症程度评估为轻或中度炎症，在服用含有罗伊氏乳杆菌的益生菌制剂后，牙龈炎症可以得到明显缓解[30]。Shimauchi等[31]发现，使用含有唾液乳杆菌WB21片剂辅助治疗有吸烟习惯的牙周病患者，其PD、PLI等评估指标优于安慰剂组，提示益生菌制剂对有吸烟习惯的牙周病患者可能有更好的治疗效果。Lauritano等[32]研究了含有多种乳酸菌的益生菌制剂Reuterinos辅助治疗种植体周围炎的临床疗效，结果发现，使用益生菌制剂4周后患者的GI明显好转，牙周致病菌数量显著下降。

表2 完全或部分证实可应用于口腔感染性疾病防治的益生菌种类Tab 2 Totally or partially proven probiotic activity and mode of action on oral infectious diseases

3 益生菌防治牙周病的相关机制

3.1 益生菌调控口腔微生态

进入口腔的益生菌可降低口腔中牙周病原菌数量，维持口腔微生态平衡。Mayanagi等[33]发现，唾液链球菌WB21可降低唾液中牙龈卟啉单胞菌和福赛斯坦纳菌的检出水平。Kõll-Klais等[34]发现，植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对牙周致病菌，包括中间普氏菌和牙龈卟啉单胞菌，表现出较高的抗菌活性。益生菌还可通过其产生的代谢产物，如乳酸、过氧化氢和细菌素等，影响菌斑生物膜的形成，而菌斑生物膜是多种疾病发生的始动因子。Krasse等[35]发现，罗伊氏乳杆菌表面存在黏附素，可增强其对口腔黏膜上皮的黏附作用，与牙周致病菌特异性竞争黏附位点，阻止菌斑生物膜的形成。罗伊氏乳杆菌还可分泌一种称为罗伊氏菌素（Reuterin）的非蛋白类细菌素，具有广谱抗菌特性，可有效抑制革兰阳性菌及阴性菌的生长。还有学者[19,21]发现，唾液链球菌M18及唾液链球菌K12可阻断病原菌的结合位点，阻碍病原菌黏附于口腔上皮。但体外研究[36]显示不同益生菌对牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌等牙周致病菌的抗菌活性并不一致，Hallström等[37]也发现，牙周病患者在服用罗伊氏乳杆菌含片后，其菌斑组成与对照组相比并无差异，故益生菌调控口腔微生态的详细机制有待进一步研究。

3.2 益生菌调控口腔局部免疫

除了作用于牙周病原菌之外，益生菌也可抑制宿主对于牙周感染的免疫应答，具有局部抗炎的功效。Twetman等[38]发现，使用含有罗伊氏乳杆菌的口香糖辅助治疗牙周炎患者，其龈沟液中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白细胞介素（interleukin，IL）-8的水平较对照组明显下降。İnce等[39]研究了益生菌辅助治疗牙周炎患者龈沟液中基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-8和基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）-1的表达水平，结果发现，对照组龈沟液中的MMP-8含量显著上升，而益生菌制剂处理组龈沟液中TIMP-1的含量显著上升。Riccia等[29]发现，经益生菌制剂辅助治疗后的慢性牙周炎患者，唾液中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的含量明显降低。还有研究[40]发现，慢性牙周炎患者服用罗伊氏乳杆菌后，龈沟液中的促炎细胞因子（TNF-α和IL-17）的表达水平明显降低。IL-6、TNF-α、IL-17是宿主单核细胞、巨噬细胞及T细胞分泌的细胞因子，具有强致炎作用；MMP-8可水解蛋白质，破坏胶原纤维，使结缔组织破坏和牙周附着丧失；TIMP-1则是重要的炎症因子抑制剂，可负向调控TNF-α的分泌；PGE2可刺激破骨细胞，造成破骨性骨吸收，导致骨丧失。由此可以发现，益生菌可通过抑制TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-8、PGE2分泌，上调TIMP-1表达水平，从而抑制牙槽骨的炎性骨吸收，达到防治牙周炎发生发展的目的。

益生菌作用于口腔时，其局部抗炎效应与直接抗菌作用可相互影响。当前关于益生菌影响口腔内的局部炎症反应的表型研究较多，但具体抗炎机制尚不清楚。Riccia等[29]利用人类髓系白血病单核细胞（human myeloid leukemia mononuclear cell，THP-1）作为模式细胞，进行相关体外研究，以直接观察益生菌的抗炎效果。该研究使用牙龈卟啉单胞菌来源的细菌内毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激THP-1细胞，在培养上清液中检出了较高水平的炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α；使用短乳杆菌CD2处理活化的THP-1细胞后，炎症因子的产生被显著抑制；进一步使用短乳杆菌CD2提取物中精氨酸脱氢酶及该酶特异性抑制剂甲脒处理后，发现甲脒的存在使得该酶的作用完全或接近完全逆转，该结果提示短乳杆菌CD2中含有的精氨酸脱氢酶是主要的抗炎物质。该研究还发现，短乳杆菌CD2提取物中的精氨酸脱亚胺酶可抑制由Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）-2及TLR-4激活引起的免疫应答反应。体外研究[35]也证实，使用LPS刺激人单核细胞及成纤维细胞后，副干酪乳杆菌LPc-G110和植物乳杆菌GOS42的使用可在一定程度上抑制其分泌炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2。

3.3 益生菌调控宿主全身骨代谢

接受益生菌辅助治疗的牙周病患者，服用的益生菌制剂不仅作用于口腔微生态，部分益生菌还可进入胃肠道组织，参与维持肠道菌群稳态及机体的全身免疫功能，进而参与调控骨重建等生理过程，抑制颌面部骨炎性吸收。研究[41]显示，益生菌制剂可通过影响肠道菌群，增加肠道菌群代谢产物丁酸，促进肠道内和骨髓中调节性T细胞的产生，激活T细胞介导调控的WNT10B信号通路，刺激骨生成。对于系统性疾病合并牙周病患者，如糖尿病、风湿性关节炎、肥胖症、骨质疏松患者，以及绝经后妇女，由于全身的免疫状态已经改变，牙周病引起的骨吸收情况往往较单纯牙周病患者更为严重，牙周治疗效果差，后期维护较为困难[42-43]。使用益生菌制剂辅助治疗牙周炎时，从口腔进入胃肠道的益生菌，可通过调节肠道微生态参与宿主全身的免疫功能及代谢，影响骨重建过程，延缓牙周的炎症骨吸收。

4 益生菌制剂的安全性评价

益生菌制剂辅助牙周炎治疗的研究是建立在多数情况下益生菌对人体是安全的，其致病可能性非常低这一基础上。虽然近年来关于益生菌不良作用也有报道，包括由益生菌引起的菌血症、感染性心内膜炎和耐药性问题，但多为散发病例，缺乏大规模的流行病学资料，且感染病例多发于免疫力低下（器官移植和癌症）患者[44]。在益生菌制剂辅助牙周炎治疗的相关临床研究中，受试者的选择标准都明确排除了免疫力异常的情况。研究[44]发现，志愿者服用唾液链球菌K12，与安慰剂组的血液指标无明显不同，其主观感受也无明显差别。迄今为止，暂无由益生菌制剂辅助治疗牙周炎引起不良反应的报道，接受治疗的牙周炎患者对相应的治疗结果基本表示满意[27,33,40]。

5 研究展望

作为现有牙周疾病基础治疗的有效补充，益生菌制剂可辅助治疗牙周病，尽管其具体治疗机制尚未完全明确，但可以肯定的是，益生菌可抑制牙周病原菌生长， 维持口腔及牙周微生态平衡，抑制宿主对牙周病原菌感染的免疫应答反应，辅助牙周病的防治。同样，进入胃肠道组织的益生菌也参与了宿主全身的免疫功能调控。笔者所在课题组在前期研究中发现，益生菌制剂灌胃饲养可抑制切除卵巢大鼠的牙槽骨吸收。深入研究益生菌通过影响肠道微生态进而调控牙槽骨代谢的相关分子机制，有望为牙周病的防治提供新的临床方法。

益生菌制剂在胃肠道疾病防治中的应用已经得到了数十年的发展，其治疗指征、适用范围、应用种类、具体剂量和益生菌的研发都有了详尽的规范和指南。口腔作为人体五大菌库之一，现有益生菌的应用标准和相关益生菌的研发相对滞后。现有的关于益生菌辅助治疗牙周病的基础与临床研究仍然参照了1999年由美国牙周病学会（American Academy of Periodontology，AAP）制定的分类标准，包括慢性牙周炎、侵袭性牙周炎等内容。2018年欧洲牙周病联合会（European Federation of Periodontology，EFP）与AAP制定了新的牙周疾病分类标准[45]。新分类标准强调根据牙周炎的严重程度以及复杂程度进行分期和分级。在新分类的指导下，益生菌制剂辅助治疗牙周病的标准应更为详尽，其适用情况、应用种类、具体剂量、使用周期等都有待进一步的研究证实，并亟需建立更为精准的临床应用规范。