章 源 杜伟锋 罗云云 赵金凯 应泽茜 葛卫红 陆兔林

（1.江干区中医院， 浙江杭州310020； 2.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心， 浙江杭州311401；3.南京中医药大学， 江苏南京210046）

乌药为樟科植物乌药Lindera aggregata（Sims） Kosterm.的干燥块根，具有行气止痛、温肾散寒的功效，用于寒凝气滞、胸腹疼痛、气逆喘急等［1］。乌药主要含有挥发油、生物碱及呋喃倍半萜及其内酯类成份。现代药理研究表明，乌药不仅具有镇痛、抗炎［2］、抗微生物、抗氧化、抗疲劳、促进胃肠动力［3］、缓解胃肠痉挛等作用，而且还对泌尿系统、中枢神经系统、妇科疾病［4］等有显著疗效。

陈藏器的《本草拾遗》 是最早收录乌药的典籍［5］，《日华子本草》 《汤液本草》 《本草求真》 对乌药也均有记载。在《本草纲目》 中，李时珍将乌药列入香木类，属木部中品。《重修政和经史证类备用本草》 记载［6］有“乌药……根状似山芍药及乌樟根，色黑褐，作车毂纹，横生。八月采根，直根不用。” 《本草图经》 载有“乌药……根以作车毂纹，形如连珠者为佳。”

目前，浙江、上海等省市的中药饮片炮制规范记载乌药以块根入药［7］。2015 年版《中国药典》 及其前几部，均明确规定块根呈连珠状，以质嫩、粉性大、横断面浅棕色者为佳，质老、不呈纺锤状的直根，不可供药用［1］。乌药原药材中，以不呈纺锤状的直根量较大，纺锤根比较有限，老根也很少。乌药直根和老根在药用品质方面是否不及乌药纺锤根，目前还没有系统地比较研究。本研究建立乌药块根HPLC 指纹图谱结合主成分分析其成分，以期为乌药质量控制、合理利用和资源开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 戴安U3000 高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Al⁃204 电子分析天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司）；数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BP210S 电子天平 （十万分之一，德国Sartorius 公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；数显电子恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 乌药内酯（批号W⁃029⁃151111，纯度≥98.0%） 购自上海顺勃生物工程技术有限公司；乌药醚内酯（批号111568⁃201204，纯度99.5%），购自中国食品药品检定研究院；乌药醇（批号ST16930120MG，纯度≥98.0%） 购自上海诗丹德生物技术有限公司。甲醇、甲酸、三乙胺、盐酸（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia 公司）；水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 乌药处理 取新鲜乌药根，根据不同形态，分得纺锤状块根10 批、直根10 批和老根6 批，趁鲜切片，60 ℃条件下烘干得乌药片。取不同批乌药片打粉过80 目筛，用于供试品溶液制备。

2.2 混合对照品溶液制备 精密称取乌药内酯、乌药醚内酯、乌药醇对照品适量，加甲醇溶解，制得含乌药内酯32.99 μg／mL、乌药醚内酯 36.17 μg／mL、乌药醇39.0 μg／mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 称取乌药粉末约0.25 g，于10 mL量瓶中，加正己烷8 mL，超声 （100 W，40 kHz） 处理1 h，冷却，正己烷定容，摇匀，取续滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 色谱条件 参考文献［8］，Agilent Eclipse XDB ⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） ⁃水（B），梯度洗脱（0～5 min，35%A；5～25 min，35%～55%A；25～33 min，55%～63% A；33～40 min，63%～62% A；40～60 min，62%～100% A；60～65 min，100%～35% A；65～70 min，35%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长235 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4” 项色谱条件下连续进样6 次，测得的图谱相似度均大于0.995，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 按“2.3” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.4” 项色谱条件下分别进样，测得6 份样品图谱的相似度均大于0.995，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取供试品溶液，在“2.4” 项色谱条件下，分别于0、3、6、9、12、24 h 进样，记录色谱图，测得的图谱相似度均大于0.995，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 HPLC 指纹图谱建立

2.6.1 色谱峰归属 将26 批不同形态乌药根（S1～S10 为乌药纺锤状块根；S11～S20 为乌药直根；S21～S26 为乌药老根），按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下分别进样，得26 批乌药样品HPLC 色谱图。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A 版” 对指纹图谱进行分析。其中保留时间稳定的共有峰15 个，在相同色谱条件下，以色谱峰保留时间和紫外扫描图谱为比较参数，将乌药指纹图谱与混合对照品溶液进行比较，指认3 个共有峰，分别为3 号峰乌药内酯、5 号峰乌药醚内酯、7 号峰乌药醇，指纹图谱见图2。

图2 26 批不同形态样品HPLC 指纹图谱

2.6.2 相似度分析 利用中药指纹图谱相似度评价软件对不同形态乌药根HPLC 指纹图谱与共有峰模式进行相似度计算，结果见表1。可知，乌药纺锤根和乌药直根相似度较高，均在0.94 以上，表明化学成分相对一致；乌药老根相似度较低，表明和乌药纺锤根、直根相比化学成分组成有较大差异。

表1 26 批不同形态样品相似度

2.7 主成分分析

2.7.1 特征值和方差贡献率 依据3 种不同形态26 批样品指纹图谱，以筛选的15 个共有峰峰面积为分析变量，将其导入SPSS 19.0 统计软件进行主成分分析，得到主成分特征值和方差贡献率、碎石图，见表2、图3。以特征值1为提取标准，筛选得到3 个主成分，特征值λ1＝8.040，λ2＝2.762，λ3＝1.950，特征值λ1贡献率53.602%，λ2的贡献率18.416%，λ3的贡献率13.002%，累计贡献率达85.019%。

表2 主成分特征值和贡献率

图3 26 批不同形态样品碎石图

由表3 载荷矩阵可知，第1 主成分主要反映了乌药内酯、乌药醚内酯、乌药醇和4、8、10、11、12、13、14 号色谱峰的主要信息，第2 主成分主要反映2、6、9 号色谱峰的主要信息，第3 主成分主要反映了1、15 号色谱峰的主要信息。

以3 个主成分为变量得到载荷图，其表示结果和初始因子载荷矩阵表相同，在三维图中距离原点较远的几个点所代表的成分就是主成分中权重系数占据较大的成分，表明其在决定不同形态乌药根质量差异上起着重大的作用。已标定的乌药内酯、乌药醚内酯和乌药醇均落在第1 主成分，且都有较大的权重值。见图4。

表3 初始因子载荷矩阵

图4 主成分分析载荷图

2.7.2 综合评价 以各主成分对应贡献率为权重系数，计算3 种形态26 批样品的主成分得分和综合得分，并进行排序，结果见表4。综合得分较高的前5 位分别为S16、S8、S5、S1、S14，其中3 个为块根、2 个为直根。从综合得分排名上看，块根、直根和老根质量差异未有清晰的界线。而从主成分1 得分排名看，块根和直根差异不显著，而6批老根排名最低。

3 讨论

药材不同药用部位、不同采收时期都会影响其质量和临床应用［9⁃11］。桑有桑叶、桑枝、桑葚等，温郁金有片姜黄、温莪术、温郁金，茯苓有茯苓和茯苓皮，莲有莲房、莲子、莲子心和莲须等不同部位；连翘有青翘和老翘，橘有青皮和陈皮不同采收时期药材，这些药虽药用部位、采收时期不同，然皆可作临床药用。而有些中药如山茱萸要去核［12］，牡丹皮要刮去粗皮，除去木心［13］；金银花宜开花前采收［14］，茵陈老枝不可药用，这些中药因部位、采收时期不同就有可药用和不可药用的区别。

表4 不同形态乌药根主成分得分、综合得分和排名统计

乌药在2015 年版《中国药典》 和大部分省市中药饮片炮制规范中规定为纺锤状块根加工而成，直根和老根不可药用。由实验结果可知，乌药块根和直根第1 主成分得分都较高，且未有明显区分，而老根排名均最低。主成分1主要反映了乌药内酯、乌药醚内酯、乌药醇等主要活性成分的相关信息，表明老根中乌药内酯、乌药醚内酯和乌药醇等成分含有量较低。从3 个主成分的综合得分分析，虽然乌药块根和直根得分大部分较高，且老根在第3 主成分中均有较高得分，表明老根相较于块根、直根可能有其他的次生代谢产物生成。

虽然有些中药部位不能加工成中药饮片使用，但并不代表它没有药用价值。对非药用部位需进行多种途径利用、加工和深加工［15］，对其中的多糖类、氨基酸类、三萜及其苷类、核苷类、黄酮类、有机酸类进行粗放低值、转化增效及精细高值等利用［16］。乌药直根无论是主成分还是其他成分，并不亚于乌药块根［8］，更何况乌药植株中直根占有相当大的比重，如不加以开发利用，将造成乌药资源的流失浪费。