柯秀梅 张立胜 李 欣 张定堃 韩 丽陈 川

（1.成都中医药大学药学院， 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地， 四川成都611137； 2.九江学院基础医学院， 九江市转化医学重点实验室， 江西九江332000； 3.九江市第三人民医院， 江西九江332000）

黄芩⁃黄连药对作为清热燥湿经典药对，常相须为用，共奏清热燥湿、泻火解毒之效［1⁃4］。其配伍用出自东汉张仲景《伤寒论》，之后备受医家重用—古人常用含黄连的方剂中，约有20%～60%属黄连黄芩配伍［5］。综观中医药经典，黄芩⁃黄连同用方中其制备工艺多为合煎，如《伤寒论》 中的泻心汤等8 个方剂；《小品方》 的犀角汤和前胡汤；《太平圣惠方》 收载的71 个黄芩⁃黄连同用方中，77.6%为合煎，余者制丸用；《千金翼方》 中除治疗消渴的丸剂外，余者66.7%方剂均合煎；《肘后备急方》 中3 方剂均合煎。

传统中医认为自沉淀是多数药物的有效成分，与汤药同服会提高临床疗效［6⁃7］。然而，现代工业中，认为黄芩⁃黄连合煎时黄酮和生物碱类成分发生络合反应产生的大量沉淀无效且消耗了有效成分，从而影响临床疗效。为避免沉淀的生成，特将其分开处理。2015 年版《中国药典》 所载含黄芩⁃黄连配伍的中成药工艺有两者分煎、粉碎、渗漉等，无一合煎。如配伍有黄芩、黄连的一清胶囊／颗粒，对2 味药的前处理为“分别加水煎煮2 次……合并煎液，滤过”；脏连丸为粉碎；葛根芩连丸／微丸／片为分别渗漉等，未见合煎者。

黄芩⁃黄连配伍合煎液内，沉淀物中的小檗碱含有量约为上清液的3 倍［8⁃10］，但有学者认为，汤剂中黄芩苷、盐酸小檗碱含有量的降低，并不意味着体系药效的降低，形成的疏水性分子复合物是汤液中有效物质的不同存在形式。课题组以黄连和黄芩中的代表性成分盐酸小檗碱和黄芩苷为模型，探索黄芩、黄连传统合煎工艺的合理性，以期丰富传统沉淀性配伍的内容。

1 材料

1.1 仪器 VERTEX70 傅里叶变换红外光谱仪、X 射线衍射仪（德国Bruker 公司）；769YP⁃15A 粉末压片机（天津市科器高新技术公司）；电子天平（德国Satouris 公司）；扫描电子显微镜（捷克Tescan 公司）；EON Ⅱ酶标仪（美国Biotek 公司）。

1.2 试剂 肉汤培养基（批号20161123，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。DMSO、甲醇和乙腈均购自美国Sigma 公司。黄芩苷提取物和盐酸小檗碱提取物（纯度≥95%，南京泽朗生物科技有限公司）。

1.3 实验菌种 金黄色葡萄球菌ATCC23672 （NRR00571，北京华越洋生物科技有限公司）；大肠埃希菌ATCC25931（BNN3280，上海北诺生物科技有限公司）。

2 实验与结果

2.1 络合物制备 调研中医药经典发现，经方中黄芩和黄连多等量配伍应用，且2015 年版《中国药典》 对黄芩中黄芩苷和黄连中盐酸小檗碱的含有量要求分别为不得少于9.0%和5.0%，故课题组将此反应中黄芩苷和盐酸小檗碱的用量比例定为9 ∶5。分别称取黄芩苷和盐酸小檗碱提取物，使其以9 ∶5 的比例溶于沸水中，回流0.5 h，室温静置，至溶液温度降至40 ℃，溶液中开始出现大量黄色絮状沉淀物，离心，收集沉淀，于60 ℃鼓风干燥，研末，备用。

2.2 络合物表征

2.2.1 络合物电子扫描显微镜下微观特点

2.2.1.1 SEM 特点 取制备好的黄芩苷、盐酸小檗碱和络合物粉末，分别在扫描电子显微镜下观察，拍摄特征图片，结果见图1。图1 显示，黄芩苷和盐酸小檗碱共热后微观结构发生了变化。

图1 各络合物SEM 图

2.2.1.2 SEM⁃EDS 特点 取制备好的黄芩苷、盐酸小檗碱和络合物粉末，在扫描电子显微镜联用能谱仪下测定表面微区元素含有量，见图2、表1。结果表明，黄芩苷和盐酸小檗碱沉淀过程中，丢失了Cl-。

图2 各络合物SEM-EDS 图（%）

表1 各络合物表面微区元素含有量SEM⁃EDS 测定结果（%）

2.3 络合物红外光谱特点 以烘干的光谱纯KBr 为空白，分别制备黄芩苷、盐酸小檗碱和沉积物的红外测试样品。每片中KBr 含有量为60 mg，样品含有量约为0.8 mg，采用FTIR⁃360 傅里叶红外光谱测定仪测定，结果见图3。

红外光谱结果表明，络合物中黄芩苷3 488.77（vOH）、3 388 （vOH） cm-1和盐酸小檗碱3 407 （vOH）cm-1吸收峰由于两者酸碱中和反应，产物存在共轭效应而向低波数3 261 cm-1方向移动。络合物与黄芩苷、盐酸小檗碱的波峰及强度有变化，有新峰产生，表明黄芩苷和盐酸小檗碱在湿热条件下发生了化学反应。

图3 各络合物IR 图谱

上述特征表明，黄芩苷和盐酸小檗碱水中共热后发生了化学变化。文献报道［1⁃3］，有机酸和生物碱的沉淀机制是酸碱络合。黄芩苷和盐酸小檗碱形成沉淀的原因可能为两者发生酸碱中和反应形成疏水性络合物［4⁃6］，逐渐沉积于汤液底部，形成沉淀。

2.4 络合物体外抗菌活性 分别精密称取黄芩苷提取物、盐酸小檗碱提取物和沉积物各0.3 g，并以甲醇溶解，于96孔板各孔中分别加入180 μL 大肠埃希菌（EL） 和金黄色葡萄球菌菌液（SA），使其菌液浓度为1×105／mL。分别加入不同浓度的药液，使黄芩苷、盐酸小檗碱和沉积物实验组中各孔药物质量浓度为 56.250 μg／mL （高浓度）、28.125 μg／mL （中浓度）、14.063 μg／mL （低浓度）、7.032 μg／mL （极低浓度） 和0 系列浓度，每个浓度设3 个复孔。于37 ℃、120 r／min 摇床培养，分别于0、12、24 h测定各孔OD值。

2.4.1 络合物对金黄色葡萄球菌的体外抑制率 于450 nm处读取金葡菌及其对照组的OD值，并计算抑菌率，采用SPSS 21 对数据进行分析，结果见表2。

表2 各化合物对金葡菌的体外抑菌率（%，， n＝3）

表2 各化合物对金葡菌的体外抑菌率（%，， n＝3）

注：同一质量浓度中，与络合物组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与小檗碱比较，ΔΔP＜0.01；同一药物组，不同质量浓度比较，＃＃P＜0.01。

由表2 可知，络合物、盐酸小檗碱和黄芩苷的体外抗金葡菌活性比较，盐酸小檗碱的活性较络合物和黄芩苷具有极显著优势，络合物又比黄芩苷有极显著性优势。各不同质量浓度药物组中，0 μg／mL 与其他浓度药物组有显著性差异外，其他各浓度药物组间均无统计学差异。各组药物的抑菌效果在加药12 h 后不再随时间的延长而有显著性差异。

2.4.2 络合物对大肠埃希菌的体外抑制率 于600 nm 处读取金葡菌及其对照组的OD值，并计算抑菌率，采用SPSS 21 对数据进行分析，结果见表3。

表3 各化合物对大肠埃希菌的体外抑菌率（%，， n＝3）

注：同一质量浓度中，与络合物组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与小檗碱比较，ΔΔP＜0.01。同一药物组，不同质量浓度比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表3 显示，络合物、盐酸小檗碱和黄芩苷的体外抗大肠埃希菌活性比较，盐酸小檗碱的活性较络合物和黄芩苷具有极显著优势，络合物又比黄芩苷有极显著性优势。各不同质量浓度药物组中，0 μg／mL 与其他质量浓度药物组有显著性差异外，其他各质量浓度药物组间均无显著性差异。各组药物的抑菌效果在加药12 h 后不再随时间的延长而有显著性差异。

3 讨论

目前，中药复方化学研究表明，水煎提取物多源自单味药的原型成分，少有配伍煎煮中产生新结构的报道；而利用诸如HPLC⁃MS、NMR 等分析手段对复方沉淀化学成分研究，并未发现新的化学实体［11］。表明中药复方水煎沉淀的原因可能是成分间的非共价结合，如范德华力、氢键作用、疏水作用、π-π 堆积作用和静电作用等，这些沉淀物的结合键能较弱，在利用现代技术分析中易被破坏，故而难以检测到。

黄芩⁃黄连合煎液的沉淀形成于有效成分间的相互作用，且络合物具有明显的抗菌活性，抗菌活性排序为盐酸小檗碱强于络合物强于黄芩苷。络合物结构中包含小檗碱和黄芩苷，理论上抑菌活性应最强，但本实验中其活性强于黄芩苷而低于小檗碱，可能是由于络合物中小檗碱的部分抑菌活性基团在络合过程中被掩蔽，而在黄芩苷的基础上引入部分小檗碱的活性基团，使得其活性处于两者之间。需要结合量子化学理论和实践，确定三者的活性基团中心并进行验证，课题组后期将进一步研究。

本研究结果证明了传统中医临床服用汤药“温服，合渣服用”［12⁃13］这一要求的科学性。若临床用汤药或工业提取过程中弃去沉淀，将在某种程度上造成药物的浪费，势必会影响临床疗效。故聚焦于临床疗效的中药复方水煎沉淀作为一种新型有效成分聚集体，具有潜在的药用价值，值得深入研究。