宋金玉 孙笑宇 吴东宁 王庆峰

（1.山西药科职业学院制药工程系， 山西太原030031； 2.北京丰台右安门医院中医科， 北京100069；3.辽宁中医药大学中西医结合学院， 辽宁沈阳110032）

血府逐瘀汤为中医临床经典名方，首载于清代王清任《医林改错》。方中以桃仁、红花、川芎、赤芍、当归活血祛瘀；牛膝祛瘀血，通血脉，引血下行；柴胡疏肝解郁，升达清阳；桔梗开宣肺气，载药上行，合枳壳升降气机，开胸行气，使气行则血行；地黄凉血清热，合当归又能养阴润燥，使祛瘀而不伤阴血；甘草调和诸药。诸药相合，共奏活血祛瘀，行气止痛之功［1］。

血府逐瘀汤在临床及基础领域取得了诸多研究成果［2］，但限于该方构成复杂，有效成分众多，因此对于其分子机制的研究尚显不足。另一方面，现有的机制研究则多集中该方对单一靶点／信号通路的调控，借以分析其起效机制［3⁃4］。然而，复方的作用靶点众多，对应通路也多有重叠，因此，如何验证及理清所获得的结果是其分子研究的难点及重点之一。而借助系统生物学及网络药理学，探索复方起效的靶点及通路网络，是当前复方研究的有效策略［5］。

考虑到血府逐瘀汤在慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF） 治疗中，获得了较好的临床效果［6］，本研究则以此为切入点，考察该方对CHF 的治疗机制。首先应用主成分分析，确定方内药物之间的相互关系及血府逐瘀汤起效的核心分子靶点；应用CTD 及DisGeNet 数据库构建CHF 的背景网络，并以血府逐瘀汤作用的分子靶点对其进行映射，以获得血府逐瘀汤作用于CHF 的分子靶点及核心分子靶点［7⁃8］；对上述分子靶点进行GO 注释和KEGG 通路功能富集，并最终确定血府逐瘀汤治疗CHF 的物质基础及分子机制。

1 材料与方法

1.1 血府逐瘀汤的数据集的采集与处理 在TCMSP 数据库（http： ／ ／ lsp.nwsuaf.edu.cn ／ tcmsp.php） 检索获得血府逐瘀汤内饮片的化学成分及对应靶点。再完成数据集的建立后，进一步遵照Lipinski 规则对所获得的靶点进行的筛选，具体筛选条件如下［9］①分子量（MW） ＜500；②脂水分配系数（Alog P） ≤5；③氢键供体数目（Hdon） ≤5；④氢键受体数目（Hacc） ≤10；在上述原则下，获得该组方的组成成分及对应靶点。整理获得的分子靶点信息，建立药物（横坐标） ⁃分子靶点（纵坐标） 数据集，该数据集内的具体数值，为药物作用不同分子靶点的重复值。

1.2 血府逐瘀汤内药物的主坐标分析 应用SIMCA 14.1软件对“1.1” 项下所得的数据进行主成分分析。根据各单味药所对应分子靶点重复值，统计出药物分子靶点的集中度，应用TBtools v0.66 软件的Heatmap 包对该重复值制作热图，并根据热图的色块变化情况，分析血府逐瘀汤内各个单味药的靶点集中度关系；SIMCA 软件内，对获得的各药物集中度的差异情况制主成分分析图，最终确定各药物之间的相互关系；对“1.1” 项下全部药物作用的分子靶点重复总值排序，取前50，将其定义为核心分子靶点。应用TBtools v0.66 软件的Heatmap 包对上述靶点的重复值做均一化处理后，制作热图，以考察上述核心分子靶点在各药物内的分布情况。

1.3 CHF 背景网络 以CTD 数据库 （http： ／ ／ctdbase.org／）［10］筛选CHF 相关的分子靶点。在“Diseases” 搜索框中输入“Chronic Heart Failure”，获得CHF 的分子靶点信息；考虑到CTD 数据库所获背景网络较大，本研究又选择了DisGeNet 数据库（http： ／ ／www.disgenet.org／）［11］进行补充，在 “Diseases” 搜索框中输入 “Congestive heart failure；CUI： C0018802：：”，获得了另一组CHF 的靶点信息，取两者交集，以获得的分子靶点信息为本研究的初始数据，并进一步以Cytosacpe3.7.1 软件构建CHF 的背景网络。

1.4 血府逐瘀汤治疗CHF 潜在靶点及功能富集 以“1.1” 项下的血府逐瘀汤分子靶点，对“1.3” 项下的CHF 背景网络进行映射，从而获得血府逐瘀汤治疗CHF 的潜在靶点，并构建“药物-有效成分-分子靶点” 网络；以“1.2” 项下获得的血府逐瘀汤核心靶点，对上述网络进行映射，以获得血府逐瘀汤治疗CHF 的潜在核心靶点，最终构建“药物-有效成分⁃核心分子靶点” 网络；应用WebGestalt 数据库 （http： ／ ／www.webgestalt.org）［12］及Cytoscape 3.7.1 软件的ClueGO 包，对获得的潜在靶点进行KEGG 和GO 功能富集，以确定血府逐瘀汤对于CHF 治疗的分子机制。

2 结果

2.1 血府逐瘀汤主要成分作用靶标筛选 经过系统筛选，共获得11 个药物的共计717 种有效成分。经过降重后，共获得588 种有效成分。获得的靶点分布情况如表1所示。

表1 血府逐瘀汤内各药物的有效成分及分子靶点统计

进一步对上述分子靶点的重复值整理后，应用SIMCA软件统计不同药物的聚类，再以TBtools 软件可视化后，可获得不同药分子物靶点分布之间的差异性区别（图1）。由图1 可知，血府逐瘀汤内功能最为相近的药对为川芎⁃当归。柴胡⁃当归、赤芍⁃当归、地黄⁃当归的分子靶点分布也比较接近。

图1 血府逐瘀汤中单味药分子靶点分布关系

以SIMCA 软件对血府逐瘀汤内不同药物做主成分分析，如图2 所示，柴胡、当归、川芎、赤芍在同一个象限内，可推测上述四者作用的分子靶点较为密切，为一个大的分子功能模块；与此同时，红花、牛膝及桔梗在同一个象限内，可推测上述三者作用的分子靶点较为密切，为另一个大的功能模块。而桃仁同其他药物相比，作用的分子靶点分布富相似度较低，结果提示，相比于其他药物，桃仁所实现的功能更为特殊。

图2 血府逐瘀汤中单味药主成分分析

2.2 血府逐瘀汤分子靶点的权重分析 获得的唯一作用靶点共计913 个，其中，重复值较高的有PTGS2 （375 个），GABRA1 （276 个），PTGS1 （218 个），CHRM1 （189 个），ADH1C （187 个），CHRM2 （164 个），CHRM3 （146 个），GABRA2 （146 个） 等，重复值前50 的分子靶点（核心分子靶点） 在不同药物内的分布情况如图3 所示。

2.3 血府逐瘀汤有效成分对充血性心衰的作用靶点 CTD数据库所获得的CHF 分子靶点共计65 771 个，选择其中经过实验验证（带M 标记） 及临床验证的基因（带T 标记）的，共计113 个。DisGeNet 数据库获得的CHF 的分子靶点共计883 个。取两者交集作为研究的背景网络，最终获得本研究拟采用的CHF 背景网络分子靶点，共计98 个。获得的分子靶点数据对其进行映射，获得血府逐瘀汤治疗的CHF 的潜在靶点共计43 个；以上述43 个分子靶点及“2.1” 项下获得的药物、化合物和分子靶点的分布情况，构建“药物⁃化合物⁃分子靶点” 的网络如图4 所示。

图3 血府逐瘀汤内药物的作用核心分子靶点分布情况

图4 血府逐瘀汤作用于CHF 的药物⁃有效成分⁃分子靶点网络

对该网络内自由度的度值分析可知，血府逐瘀汤成方药物中，甘草的度值最高，为114，提示其共有114 个有效成分可作用于CHF 的分子靶点，其次是柴胡（88），川芎（77），当归（43） 及红花（38）。而桃仁的度值最低，仅为4。另一方面，筛出的43 个分子靶点平均度值为29.3，共有8 个分子靶点大于平均度值；而化合物的平均度值为4.7，共有139 个化合物的自由度大于平均自由度，共有8个化合物的自由度大于15，证明上述成分可调控的CHF 的潜在靶点较多，为血府逐瘀汤内的主要成分。图4 内度值较高的有效成分及分子靶点信息如图5 所示。

图5 血府逐瘀汤作用于CHF 的有效成分及核心分子靶点自由度分布

本研究筛选了血府逐瘀汤内重复值较高的50 个靶点。将其映射入图4 的网络内，最终筛选出其作用的主要分子靶点包含6 个，分别为PTGS2、PTGS1、NOS2、PPARG、GSK3B 及ADRB1。引入“2.1” 项下药物及有效成分的信息后，构建血府逐瘀汤作用于CHF 的“药物⁃有效成分⁃核心分子靶点网络” 如图6 所示。

对图6 的网络的自由度度值分析后可知，甘草（111）、柴胡（84）、川芎（73）、当归（42） 和红花（35） 的度值高于平均度值。考虑到“药物⁃核心分子靶点” 的度值同“药物⁃分子靶点” 的度值类似，结果进一步验证，上述6个分子靶点为血府逐瘀汤治疗CHF 的核心分子靶点。为进一步的理清上述有效成分在CHF 治疗过程中的起效机制，本研究将筛选出的43 个核心靶点进行功能富集，并重点考察筛选出的6 个核心分子靶点的分子功能。以最终确定血府逐瘀汤对于CHF 的治疗机制。

2.4 血府逐瘀汤对充血性心衰的治疗机制 由图7～8 的统计结果可知，血府逐瘀汤内43 个核心靶点主要调节的通路有3 类，分别为调控内皮细胞功能（血液剪切力及动脉粥样硬化通路），调控缺氧应激反应（HIF⁃1 信号通路），诱导心肌细胞凋亡及血管重构（TNF 和AMPK 信号通路），血管炎症（IL⁃17 信号通路） 等。根据功能富集结果可知，在CHF 的过程中，血府逐瘀汤通过调控一系列通路，多角度、多靶点缓解疾病的发生和发展。

3 讨论

血府逐瘀汤具有活血祛瘀、行气止痛之功［1］，能够有效的治疗慢性心力衰竭。现代药理学研究表明，桃仁、红花可改善血流动力学、抗凝血［13］；赤芍可舒张血管［14］，川芎可改善心肌缺血［15］等作用。尽管目前针对血府逐瘀汤内药物的药理学活性的研究已经较为深入，但其治疗CHF 机制的报道却不多。

本研究尝试应用主成分分析方法，对方内药物的关系进行分析以证实其配伍关系。由结果可知，同其他药物相比，君药桃仁作用的分子靶点分布相似度较低，推测桃仁在CHF 治疗的过程中，同其他药物起效机制有所不同。赤芍⁃川芎在方内主要辅佐为桃仁红花活血化瘀，而该药对的相似度较高。臣药牛膝的功效祛瘀通脉、引瘀血下行，因此，其分子靶点分布同赤芍⁃川芎药对差异性较远。使药中，当归⁃地黄药对相似度较高，两药除祛瘀外，亦有协同养血凉血润燥的功效。桔梗主要作用于上焦，引气上行，而枳壳作用于中焦，理气宽中行滞，因此，桔梗⁃枳壳药对差异性较大。柴胡疏肝理气，其分子靶点的分布情况同赤芍及川芎较为接近。

本研究获得的 “中药⁃成分⁃分子靶点” 网络中，salicylic acid （水杨酸）、naringenin （柚皮素）、lauric acid（月桂酸）、isorhamnetin （异鼠李素）、luteolin （木犀草素）、kaempferol （山柰酚） 以及quercetin （槲皮素） 等自由度较高。其中，以阿司匹林为代表的水杨酸类药物［16］，是临床治疗CHF 的常用一线药物；而Testai 等［17］研究证实槲皮素，可以通过激活mitoBK 通道，以实现心肌保护作用，另外，槲皮素也可直接作用于血管平滑肌细胞（VSMCs）［18］，从而直接调节该细胞的氧化应激表型，并进一步的降低动脉粥样硬化的发生。上述有效成分，都被广泛的报道可治疗CHF。异鼠李素也是黄酮的一种，大量研究显示，异鼠李素有较强的心血管保护作用。其潜在的机制包含NF⁃κB 通路的调节［19］及直接作用于SIRT1 分子靶点，从而抑制心肌细胞的凋亡［20］等；木犀草素也有较强的心肌保护作用，其可直接抑制异丙肾上腺素所致的心衰大鼠的外周淋巴细胞损伤［21］，同时，木犀草素也可通过抑制ROS 分子，进而激活的MAPK 通路以实现心肌保护作用［22］。山柰酚也被证实有广泛的心脏保护作用，其作用的表型包含炎症抑制、氧化应激［23］，作用的通路包含NF⁃κB和PI3K／AKT／GSK3B 等［24］。槲皮素同山柰酚类似，也有较强的心脏保护作用。其可调节心脏的氧化应激、抑制炎症反应，并改善心肌细胞的凋亡［25］；另外，槲皮素也直接影响心脏对NO 代谢的影响，进而缓解心肌的损伤［26］。

图6 血府逐瘀汤作用于CHF 的药物⁃有效成分⁃核心分子靶点网络

在“中药⁃成分⁃核心分子靶点” 网络中，自由度最高的分子靶点分别为前列素内环氧化物合成酶2 （PTGS2）、前列素内环氧化物合成酶1 （PTGS1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、过氧化物酶体增殖因子活化受体γ （PPARG）、糖原合成酶激酶3β （GSK3B） 及β1 肾上腺素受体（ADRB1） 等靶点。可确定，上述靶点是血府逐瘀汤治疗CHF 的核心靶点。PTGS2 也称为环氧合酶⁃2 （COX⁃2），COX⁃2 过表达会增加局部组织前列腺素（PG） 的合成，刺激炎症反应，而其介导CHF 发病的主要原因正是通过诱导血管炎症，并进一步诱发心脏肥大及重塑所致［27］。PTGS1是花生四烯酸代谢产生血栓素A2 过程中关键限速酶，通过抑制PTGS1 的活性，可以大幅降低血栓素的表达，并进一步限制血小板的过度聚集［28］。NOS2 为诱导型一氧化氮合成酶，可调节体内NO 的浓度［29］。随血液内NO 浓度的增加，产生相应的抗炎及抗动脉粥样硬化作用［30］。PPARG 主要参与脂类的分解代谢等［31］，针对其在心脏类疾病的功能研究不多，但是大量的疾病多态性研究显示，PPARG 同心血管疾病的发生密切相关［32⁃33］。GSK3B 主要参与糖代谢调节及胰岛素应答［34］，同时嵌套进了大量炎症反应的通路。其同CHF 的联系主要是通过NF⁃κB 信号通路得以实现［35］，而NF⁃κB 信号通路则是CHF 发病过程中，重要的血管炎症及心肌细胞凋亡通路［36］。ADRB1 其主要在肾上腺素的功能实现过程中，发挥信号传导作用。该靶点多应用于遗传多态性研究，特别是在心血管疾病易感性研究中，ADRB1 被广泛的报道［37⁃38］。综上可知，血府逐瘀汤可通过调节上述6 个核心分子靶点实现其对CHF 的治疗目的。

富集分析结果可知，在该治疗过程中主要涉及通路可能是血液剪切力及动脉粥样硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis），HIF1 信号通路，AMPK 信号通路、TNF 信号通路及IL⁃17 信号通路等。作为CHF 发生过程中，最重要的上游通路，血液剪切力及动脉粥样硬化通路可直接介导一系列CHF 的下游通路，如MAPK、NF⁃κB、PI3K、及JAK 等［39］。而其通路本身，除了信号传导功能外，也直接调节血管内皮细胞的功能。HIF1 通路主要调节心脏的代偿性，可以有效的缓解心脏由缺氧所带来的代偿性损伤［40］。然而，在CHF 的过程中，随着心脏长时期的缺氧，HIF1 的不断上调，持续的氧化应激，会加速心肌细胞的凋亡，引起心脏损伤［41］。另一方面，CHF 所诱发的炎症反应会造成局部低氧环境，亦会激活HIF1 通路，并进一步的激活HIF1 下游的NF⁃κB 通路，加重炎症损伤［42］。同HIF1 的功能类似，AMPK 信号通路也同心肌的代谢有关。随着氧摄入的不足，AMPK 信号通路会随之活化，其可通过启动内源性的能量保护机制，从而提升心肌细胞对于缺氧状态的耐受。该通路是重要的缺氧保护通路，而随着AMPK 信号通路的抑制，心肌细胞的凋亡会持续进行［43］。而血府逐瘀汤在AMPK 信号通路上有多个作用靶点，可以证明其有潜在心肌缺氧保护作用。TNF 信号通路同CHF 作用关系的机制有二，除了作为上游信号调控下游的NF⁃κB 通路外；TNF 也可通过 TNFR1⁃TRADD⁃FADD 途径招募 FLICE（FADD⁃like ICE） ／MACH （MORT1⁃associated CED⁃3 homo⁃log） ／caspase⁃8，再激活caspase⁃3，最终诱导细胞凋亡［44］；推测该路径在心肌细胞凋亡的过程中，也发挥了重要的作用。IL⁃17 则是CHF 重要的炎症通路，针对诱发了CHF 的对心肌炎症损伤的研究较多，其可通过介导的炎症反应，直接损伤心肌细胞，从而加速心血管疾病、心功能损伤的进展过程。另外，随着的IL⁃17 的激活，其可释放多种炎症因子和中性粒细胞趋化因子，加剧血管内的炎症反应，并进一步的促进动脉粥样硬化及心脏重塑的发生［45⁃46］。同时，IL⁃17 又可直接调控其下游的NF⁃κB 信号通路，从而诱发心肌细胞凋亡的发生。此外研究发现，物质代谢、生物调节、生物膜跨膜传输、外源信号传导等生物过程。结果提示，血府逐瘀汤对于CHF 的治疗，主要是通过对物质代谢的调节及生物信号传导的控制得以实现。由上述结果可知，血府逐瘀汤治疗CHF 的机制包含调控内皮细胞功能，缓解缺氧应激反应，保护心肌细胞凋亡及血管重构和降低血管炎症反应等。

图7 血府逐瘀汤核心作用靶点的KEGG 通路分析

图8 血府逐瘀汤核心作用靶点的GO 功能分析

4 结论

作为经典方剂，血府逐瘀汤成方复杂，其临床可治疗多种心血管相关疾病。经典药理学已经对血府逐瘀汤对心脏的治疗机制进行了深入全面的研究，然而，在分子机制层面，限于该方作用靶点较多，药物配伍关系复杂，极大的限制了其进一步的深入研究。本研究借助生物信息学手段，对该方进行系统分析，对于其中药物的配伍关系，进行了初步研究，并进一步的应用网络药理学手段，对其作用靶点进行分析，并最终获得了血府逐瘀汤治疗CHF 的潜在机制，以此为基础，针对已经获得的目标靶点及通路做进一步深入的验证，最终获得血府逐瘀汤对心脏系统疾病治疗的机制。另一方面，也为传统方剂的现代研究，提供新的思路和方法。