代 震 朱 昱 王治阳

（1.河南省中医药研究院， 河南郑州450004； 2.河南中医药大学， 河南郑州450008）

脑血管意外是危害我国老年群体的常见疾病之一，近年来脑血管疾病的发病率呈上升趋势，这与我国老年化进程加快息息相关［1］。缺血性脑血管疾病（ischemic cerebral vascular disease，ICVD） 是脑血管意外中第1 位致残性疾病，患者可出现不同程度的运动、感觉障碍；同时也是第2 位致死性疾病［2］。目前对缺血性脑血管疾病治疗包括超早期溶栓治疗、抗凝治疗、抗血小板治疗、介入治疗（脑血管内）、神经细胞保护治疗以及外科手术（大面积脑梗死标准去骨瓣减压术） 等［3］。早期溶栓治疗后缺血区脑组织恢复供血的过程又称之为“再灌注”，此时患者的神经功能恢复情况极大影响预后［4］。本研究以脑缺血再灌注损伤大鼠为模型，探讨不同剂量当归多糖对大鼠神经功能和炎症因子等影响。

1 材料

1.1 动物 健康清洁级SD 大鼠60 只，雄性，体质量（210±20） g，购自河南中科联创检测服务有限公司，实验动物许可证号SYXK （豫） 2017⁃0027。所有大鼠分笼饲养，由专人负责管理。实验室定期消毒，环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。饲养1 周后开始实验。本研究经本院实验动物伦理委员会批准（HNZYYYJ2017⁃0012），符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

1.2 仪器 线栓（广州佳灵生物科技有限公司）；MH550冰冻切片机（美国Thermo Fisher 公司）；光学显微镜（洛阳惠尔纳米科技有限公司）；组织捣碎匀浆机（天津博天胜达科技发展有限公司）；台式离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；自动酶标仪（昆山吉和力仪器有限公司）；超净工作台（苏州净化设备仪器公司）。

1.3 药物与试剂 当归多糖（Angelica sinensis polysaccha⁃ride，ASP） 购自陕西慈缘生物技术有限公司［甘肃岷县当归提取，批号CY150407，纯度≥98%，组分主要包含半乳糖（35%）、阿拉伯糖（30%）、葡萄糖（21%）］；水合氯醛（武汉华申化学试剂有限责任公司）；IL⁃1β、TNF⁃α 检测试剂盒（美国RD 公司）；NF⁃κB、GAPDH 一抗购于美国Cell Signaling 公司。

2 方法

2.1 分组 将饲养1 周后的大鼠称定质量后，随机分为假手术组、模型组、当归多糖低剂量组（30 mg／kg）、当归多糖中剂量组（45 mg／kg）、当归多糖高剂量组（60 mg／kg），每组12 只。预给药14 d，当归多糖低、中、高剂量组灌胃给药，1 次／d。假手术组和模型组灌服等容量的生理盐水。

2.2 缺血再灌注模型 建立大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 模型［5］。制备模型的大鼠术前12 h 禁食，不禁水。大鼠采用腹腔注射麻醉，麻醉药物选择10%水合氯醛，剂量为350 mg／kg。显微镜下找到大鼠左侧颈外动脉（External carotid artery，ECA），穿缝合线结扎ECA；在颈总动脉（Common carotid artery，CCA）近分叉处用动脉夹夹闭其近心端，在距分叉处约0.5 cm 血管壁上剪一小口，夹取栓线沿切口插入，送入栓线，当栓线推进到分叉处时，轻轻提起ECA，使栓线顺利进入颈内动脉（Internal carotid artery，ICA），继续轻柔推进，当感到有一定阻力时即停止推送，此时栓线头端正好位于大脑中动脉（MCA） 起始部位，阻断MCA 血流，停留90 min后，将栓线轻轻拔出恢复血流灌注。结扎颈外动脉，缝合皮肤。术中用加热毯和白炽灯加热，维持大鼠肛温在 （37.5±0.3）℃，术后将大鼠置于恒温箱中直至苏醒。假手术组同样进行手术操作，不通过颈总动脉插入线栓。

2.3 神经功能评定

2.3.1 神经功能评分 参考文献［6］。在大鼠恢复再灌注24 h 后进行评定。包括运动实验、感觉实验和反射测试三部分。运动实验包括提尾实验（3 分） 和地板行走（3分）；感觉实验包括放置实验（1 分）、本体感觉实验（1分）、平衡木实验（6 分）；反射测试（4 分） 包括耳廓反射、角膜反射、惊恐反射以及癫痫，肌痉挛。最高18 分。分数越高表明该大鼠神经功能越好。

2.3.2 抓力实验 选择合适的大鼠抓力板，建模前大鼠均进行适应性训练。测试过程中保持环境安静，不要过分刺激大鼠，重复测量3 次，测大鼠抓力的平均值。

2.4 炎症因子指标 ①血清白介素⁃1 （IL⁃1β）、肿瘤坏死因子（TNF⁃α），再灌注2 d 后抽取大鼠动脉血1 mL，静置30 min 后离心分离血清，采用ELISA 法检测IL⁃1β、TNF⁃α水平，所有步骤均严格按照试剂盒操作流程。②脑组织IL⁃1β、TNF⁃α，将各组大鼠麻醉后断头取出脑部组织，加入4 ℃生理盐水（1 ∶9），匀浆后去上清液，采用放射免疫法测IL⁃1β、TNF⁃α 水平。③脑组织NF⁃κB 采用Western blot 法检测，将取得的脑组织匀浆用RIPA 裂解液，取15 g总蛋白进行电泳，电泳结束后加入NF⁃κB 抗体，于4 ℃冰箱过夜，洗膜，曝光拍照，通过Image Pro 软件比较NF⁃κB与GAPDH 蛋白条带灰度的比值表示NF⁃κB 蛋白相对表达量。

2.5 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，计量资料以（） 表示，多组间比较采用方差分析，以P≤0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 当归多糖对大鼠神经功能的影响 如表1 所示，模型组大鼠的神经功能评分和抓力低于假手术组（P＜0.05），当归多糖中、高剂量组神经功能评分和抓力高于模型组（P＜0.05）。

表1 当归多糖对大鼠神经功能的影响的比较（， n＝12）

表1 当归多糖对大鼠神经功能的影响的比较（， n＝12）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.2 当归多糖对大鼠血清和脑组织IL⁃1β 水平的影响 如表2 所示，模型组血清和脑组织中IL⁃1β 水平高于假手术组（P＜0.05），同时当归多糖中、高剂量组IL⁃1β 水平低于模型组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清和脑组织IL⁃1β 水平比较（pg／mL，， n＝12）

表2 各组大鼠血清和脑组织IL⁃1β 水平比较（pg／mL，， n＝12）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.3 当归多糖对大鼠血清和脑组织TNF⁃α 水平的影响 如表3 所示，模型组血清和脑组织中TNF⁃α 水平高于假手术组（P＜0.05），同时当归多糖中、高剂量组TNF⁃α水平低于模型组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清和脑组织TNF⁃α 水平比较（ng／mL，， n＝12）

表3 各组大鼠血清和脑组织TNF⁃α 水平比较（ng／mL，， n＝12）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.4 当归多糖对大鼠脑组织中NF⁃κB 蛋白表达的影响 如表4 所示，模型组脑组织中NF⁃κB 蛋白表达高于假手术组（P＜0.05），同时当归多糖中、高剂量组NF⁃κB 蛋白表达明显低于模型组。

4 讨论

脑缺血在中医上属于“中风” 范畴，王清任《医林改错》 认为“气血凝滞脑气”，陈土铎《辨证录》 所言“痰积则神明不清”［7］。多糖是一类天然高分子化合物，具有广泛的生物学功能。当归产地主要分布在甘肃、陕西、湖北、云南、四川等省，其中甘肃岷县所产当归品质最好［8］。作为一味中药它主要作用于血液系统，当归的主要活性物质当归多糖，具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤等作用，被广泛应用于老年疾病［9⁃10］。

表4 各组大鼠脑组织中NF⁃κB 表达的比较（， n＝12）

表4 各组大鼠脑组织中NF⁃κB 表达的比较（， n＝12）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。

脑缺血再灌注损伤的机制目前仍不清楚，现认为与大脑内富含氧自由基有关。缺血大脑再灌注后，产生过多氧自由基不能被大脑内生性抗氧化系统所消除，从而对脑脂质、蛋白质和核酸造成氧化损伤，进一步损伤神经细胞，导致神经功能障碍［11⁃12］。受损的神经细胞会产生大量炎症因子。IL⁃1β 属于白细胞介素⁃1 （IL⁃1），是一种重要的促炎症介质并在细胞免疫中发挥作用，主要由单核巨噬细胞产生［13］。TNF⁃α 是由活化的单核巨噬细胞释放的促炎因子，能提高中性粒细胞的吞噬功能，具有抗感染、促进炎细胞分化的作用，诱导神经细胞膜上信号通路传导异常，当与白介素协同时，对脑微血管内皮细胞刺激作用增强［14⁃15］。IL⁃1β 能够激发靶细胞内NF⁃κB 信号通路［16］。

本研究结果显示，模型组大鼠的神经功能评分和抓力明显低于假手术组，当归多糖中、高剂量组神经功能评分和抓力明显高于模型组。说明当归多糖中、高剂量能改善缺血再灌注大鼠的神经功能。考虑可能与当归多糖清除脑部过量炎症因子有关，从而减少炎症反应对神经细胞的损伤。本研究结果显示，模型组血清和脑组织中IL⁃1β、TNF⁃α 水平明显高于假手术组，同时当归多糖中、高剂量组IL⁃1β、TNF⁃α 水平明显低于模型组。模型组脑组织中NF⁃κB蛋白表达明显高于假手术组，同时当归多糖中、高剂量组NF⁃κB 蛋白表达明显低于模型组。说明随着当归多糖剂量的增加，可以有效降低大鼠血清和脑组织中炎症因子水平，尤其是高剂量当归多糖（60 mg／kg） 效果较好。高剂量当归多糖可能通过降低血清中IL⁃1 和TNF⁃α 水平，并进一步阻断神经细胞内NF⁃κB 信号通路，减少大量的氧自由基通过细胞膜上的信号通路进入神经细胞内，损伤脑组织［17］。

综上所述，预给药当归多糖（60 mg／kg） 可以减轻缺血再灌注大鼠脑组织中的炎症反应，有助于大鼠神经功能恢复。