刘剑敏 董俊丽 唐静宜 陈 凡

（武汉市第一医院， 湖北武汉430022）

缺血性脑损伤致残率和致死率高，是人类生命健康的重要威胁［1］；因此，开发治疗脑缺血再灌注损伤的药物是当前研究的热点之一。大量研究结果表明，川芎嗪可保护线粒体［2］、促进能量代谢［3］、清除氧自由基、抗炎［4］、抑制钙超载、维持细胞钙稳态［5⁃6］、抗细胞凋亡［7］等多方面抗心脑细胞缺血再灌注损伤及感染性脑水肿所致的脑组织损伤。同时，也有研究［8］表明川芎嗪对脑微血管内皮细胞损伤具有一定保护作用。川芎嗪对脑神经细胞缺血再灌注损伤的保护机制仍未明确。本实验采用小鼠海马神经元HT22 细胞，通过氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD） 的方法离体模拟脑缺血再灌损伤，初步探讨磷酸川芎嗪对HT22 细胞摄取葡萄糖能力及保护作用机制。

1 材料

1.1 细胞株 小鼠海马神经元细胞系HT22 细胞（武汉大学典型培养物保藏中心）。

1.2 药物与试剂 磷酸川芎嗪（中国食品药品检定研究院，纯度为99.2%，批号100845⁃201702），临用前用培养基配成相应浓度，过滤除菌后备用；DMEM／F12 培养基、胎牛血清、胰酶（美国Gibco 公司）；CCK⁃8 试剂盒（碧云天生物技术研究所）；DMSO （美国Sigma 公司）；连二亚硫酸钠（南京化学试剂一厂）；p⁃AMPK 抗体（Thr172，兔抗鼠一抗）、AMPK 抗体（美国Cell SignalingTechnology 公司）；其余试剂均为国产市售分析纯。磷酸盐缓冲液用前稀释使用。

1.3 仪器 2306⁃2 型CO2培养箱（美国Shellab 公司）；SW⁃CJ⁃2FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；BX⁃51 型倒置相差显微照相系统（日本Olympus 公司）；ELX8 全自动酶标仪（德国Bioztek 仪器公司）；Western blot电泳装置 （美国Bio⁃Rad 公司）；Western blot 转膜装置（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（以色列DNR 公司）。

2 方法

2.1 HT22 细胞培养 HT22 细胞培养采用含10%灭活胎牛血清的高糖DMEM 培养基，细胞常规培养于37 ℃、平衡湿度、含5%CO2和95%O2的培养箱中培养。细胞常规复苏后传代1～2 代进行模型建立，以后每隔2 d 全量换液，或根据培养基颜色定期换液，直到相关实验结束。

2.2 造模与分组 当HT22 细胞长至近70% 时，用0.125%胰酶消化，调整细胞浓度至1×105个／mL，接种于24 孔板，继续培养细胞长满单层厚进行分组。因在缺血性脑损伤治疗领域明确具有能量代谢机制的阳性对照药缺乏，故未设置阳性对照。将细胞随机分为空白对照组、模型组、磷酸川芎嗪（5、10、15 μg／mL） 组，每组6 孔，磷酸川芎嗪在OGD 前预处理24 h。上述各组孵育24 h 后，空白对照组各孔加入2 mL 高糖DMEM 培养基，OGD 模型组和磷酸川芎嗪预处理组各孔加入含连二亚硫酸钠（2 mmol／L）的无糖DMEM 培养基，于培养箱内（37 ℃，5% CO2、95%N2） 孵育4 h，最后复糖复氧24 h。以CCK⁃8 试剂盒测定各组细胞存活率，细胞存活率＝（OD给药组／OD空白对照组）×100%。

2.3 葡萄糖摄取能力检测 参考文献［9⁃10］，测定磷酸川芎嗪对HT22 细胞葡萄糖摄取能力的影响。通过检测2⁃脱氧葡萄糖荧光类似物（2⁃ ［N⁃ （7⁃nitrobenz ⁃2⁃ oxa ⁃1，3 ⁃diaxol ⁃4⁃yl） amino］ ⁃2⁃ deoxyglucose，2⁃NBDG） 的荧光强度来评价各组细胞对葡萄糖摄取活性。各组处理后的HT22 细胞，加入2⁃NBDG （100 μmol／L） 孵育30 min，以4 ℃PBS 清洗3 次，设定激发波长为488 nm，发射波长为542 nm，通过荧光显微镜及全自动酶标仪探测各孔荧光强度，并通过荧光强度与每孔细胞的数量比值表示HT22 细胞葡萄糖摄取能力，最后结果以空白对照组为100% 进行换算。

2.4 Western blot 法检测HT22 细胞AMPK、p⁃AMPK 蛋白表达 收集各组实验处理后的HT22 细胞，以蛋白提取试剂盒进行总蛋白提取，采用BCA 法检测蛋白浓度。采用SDS⁃PAGE 电泳，配制10%分离胶，5%浓缩胶，蛋白上样量为30 μg，进行电泳 （80 V，30 min；随后110 V，60 min），切胶，转膜（250 mA 恒流，90 min），室温下5%脱脂奶粉封闭90 min，TBST 清洗后，加入一抗p⁃AMPK（1 ∶500）、AMPK （1 ∶500）、β⁃actin （1 ∶2 000），4 ℃孵育过夜；TBST 清洗，加入二抗孵育（1 ∶2 000） 孵育1 h。TBST 清洗3 次，将ECL 发光液A、B 各500 μL 等量混合后，将NC 膜浸泡在混合液里，避光1 min，扫描仪扫描条带，应用Image J 软件对蛋白信号结果进行分析。

2.5 统计学分析 利用SPSS 22.0 软件进行统计分析，并使用Graph Pad Prim 6 软件绘图，数据以（） 表示。多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD 法，以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 磷酸川芎嗪对HT22 细胞活性的影响 如图1 所示，OGD 模型组HT22 细胞核固缩，胞体膨胀甚至破裂，细胞膜不完整，折光性差；随着磷酸川芎嗪浓度的增加，HT22细胞胞体变得饱满，边缘逐渐光滑，且有较强折光性；从细胞形态学上，磷酸川芎嗪对OGD 损伤HT22 细胞具有保护作用。如图2 所示，与空白对照组比较，模型组HT22细胞存活率降低（P＜0.01），而磷酸川芎嗪预处理后，随着浓度增加，细胞存活率呈升高趋势，其中磷酸川芎（10、15 μg／mL） 存活率升高（P＜0.05，P＜0.01）。

3.2 磷酸川芎嗪对HT22 细胞2⁃NBDG 的摄取的影响 如图3 所示，与空白对照组（100±0.26）%相比，经OGD 处理后HT22 细胞对2⁃NBDG 的摄取能力下降 ［（45.17±0.92）%，P＜0.01］；经5 μg／mL 磷酸川芎嗪预处理后，细胞对2⁃NBDG 的摄取能力增加到（75.37±2.08）%；与模型组比较，15 μg／mL 磷酸川芎嗪预处理下的HT22 细胞对2⁃NBDG 的摄取能力增加到［（108.00±3.02）%，P＜0.01］。糖氧剥夺造成HT22 细胞活性下降，对2⁃NBDG 的摄取能力显著下降；磷酸川芎嗪预处理可提高HT22 细胞对2⁃NBDG的摄取能力。

图1 各组HT22 神经元形态学变化（标尺＝50 μm）

图2 磷酸川芎嗪对HT22 细胞存活率的影响（n＝3）

图3 磷酸川芎嗪对HT22 细胞2⁃NBDG 摄取的影响（n＝3）

3.3 磷酸川芎嗪对糖氧剥夺下HT22 细胞p⁃AMPK 蛋白表达的影响 如图4 所示，与空白对照组比较，OGD 并不改变HT22 细胞中AMPK 表达，磷酸川芎嗪预处理也不改变HT22 细胞中AMPK 表达。与空白对照组比较，OGD 上调HT22 细胞中p⁃AMPK 的表达（P＜0.05）；同时，HT22 细胞p⁃AMPK 随着磷酸川芎嗪浓度的增加而增加，其中15 μg／mL 磷酸川芎嗪组p⁃AMPK 增加具有统计学意义（P＜0.05）。以上实验结果表明OGD 能促进HT22 细胞p⁃AMPK的表达，同时，磷酸川芎嗪预处理明显激活AMPK 而上调p⁃AMPK 的蛋白表达。

图4 各组细胞p⁃AMPK、AMPK 蛋白表达（n＝3）

4 讨论

缺血性脑损伤有很高的致残率和致死率，是威胁人类生命健康的一个重要原因，因此，其预防和治疗非常重要。短时氧糖剥夺可模拟在某些疾病状态下（如脑卒中） 引起的氧糖供应缺乏，延时再灌则反映氧糖供应缺乏的基础上恢复氧糖供应后细胞的损伤状况，即氧糖剥夺再灌注可模拟机体的缺血⁃再灌注损伤。本研究采用小鼠海马神经元细胞系HT22 细胞，是为了更好的模拟缺血⁃再灌注损伤时脑内神经元的活性变化。

2⁃脱氧葡萄糖（2⁃DG） 为天然D 型葡萄糖衍生物，其2 位氧可被荧光基团NBD 取代，成为荧光标记的2⁃NBDG。它与2⁃DG 类似，都可通过葡萄糖转运体GLUT1 识别转运入细胞内［9］。2⁃NBDG 常被用作细胞葡萄糖摄取的敏感探针，细胞摄取2⁃NBDG 后荧光强度的变化可以通过荧光酶标仪、激光共聚焦扫描成像和流式细胞仪等技术检测，其中以荧光酶标仪检测法更简单快速易行［10］。本研究发现在OGD 发生后，HT22 细胞活性下降，对2⁃NBDG 的摄取能力大大下降；在磷酸川芎嗪预处理下，HT22 细胞对2⁃NBDG的摄取能力随着磷酸川芎嗪浓度的增加而逐渐增加，这提示磷酸川芎嗪对神经元缺血再灌注损伤的保护作用，可能与细胞对葡萄糖的摄取有关。

研究者发现AMPK 通过增加在胞内的葡萄糖转运以及糖酵解，维持AMP 与ATP 稳态，而使得细胞生存［11⁃12］。本研究中无论是OGD 处理，还是磷酸川芎嗪预处理均不改变HT22 细胞中AMPK 的表达；然而，OGD 可以激活HT22细胞AMPK，上调p⁃AMPK 表达。AMPK 作为细胞能量代谢的关键调节器，正常生理条件下无活性，任何导致AMP／ATP 升高的因素（如缺血缺氧、氧化应激等），均会激活AMPK［13］。本研究中随着磷酸川芎嗪浓度的增加，HT22 细胞对2⁃NBDG 摄取能力的增加，是否与p⁃AMPK 表达上调存在一定关联，值得进一步研究。磷酸川芎嗪有可能通过激活AMPK，增加在胞内的葡萄糖转运，而发挥对神经元缺血再灌注损伤的保护作用。p⁃AMPK 参与产能反应，促进葡萄糖摄取、糖酵解等，使得ATP 产生增加，同时抑制蛋白质合成等耗能反应，减少ATP 消耗［14］。在短期能量缺乏下，p⁃AMPK 通过促进星形胶质细胞增加糖酵解［15］。也有研究表明长时间过度激活AMPK 会加重脑组织损伤，Compound C （AMPK 抑制剂） 具有神经保护作用［16］。产生以上不一致结果的原因可能与实验细胞、模型制作等差异有关［17］。如何在合适的时间给予合适强度的激活AMPK 干预，可能是实现脑缺血保护的关键。

综上所述，在HT22 细胞氧糖剥夺损伤模型中，磷酸川芎嗪预处理可上调p⁃AMPK 表达，增加HT22 细胞的对葡萄糖的摄取，维持了胞内的能量平衡，从而发挥对缺血再灌注损伤的保护作用。