赵 新

（周口职业技术学院， 河南周口466000）

据国际糖尿病联盟的统计数据显示，全球糖尿病患者总数为4.25 亿，而中国糖尿病发病人数位列全球第一，高达1.14 亿，且发病率呈现逐年递增趋势［1］。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN） 为糖尿病最为常见的并发症，30%～40%糖尿病患者会出现DN，危害严重［2］。当前，微循环障碍、糖代谢紊乱、氧化应激、炎症反应及胞内信号转导异常是DN 发病的主要机制［3］。肾组织炎症因子大量表达及TLR4／NF⁃κB 信号通路异常，可导致肾小球系膜细胞增殖而使间质纤维化，进而促进DN 的发生、发展［4⁃5］。汉黄芩苷为传统中药黄芩中的黄酮类单体物质，具有降血糖、抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤及保护神经、心血管系统等多种药理活性［6］。研究发现［7］，汉黄芩苷具有增加糖原合成改善肝胰岛素抵抗及促进HepG2 细胞葡萄糖摄取等作用，其机制与降低炎症因子表达及激活胰岛素降糖通路有关，但目前关于汉黄芩苷治疗DN 的研究报道较少。本研究通过给予链脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 诱导的糖尿病模型大鼠不同剂量的汉黄芩苷，旨在探讨其是否具有肾组织保护作用，并以肾组织炎症因子表达及TLR4／NF⁃κB 信号通路为切入点，研究其作用的分子机制。

1 材料

1.1 动物 雄性SD 大鼠，SPF 级，体质量（200±20） g，由河南省实验动物中心提供，生产许可证号SCXK （豫）2017⁃0001。

1.2 药物与试剂 汉黄芩苷 （纯度＞90%，批号2019021601） 购自成都彼样生物科技有限公司，汉黄芩苷用0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose⁃Na，CMC⁃Na） 配成10 mg／mL 混悬液，作为贮备液。STZ 购自大连美仑生物技术有限公司；血糖、胰岛素（insulin，INS）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿微量白蛋白（urine microalbumin albumin，UmAlb） 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；血肌酐（serum creatinine，Scr） 检测试剂盒购自厦门宝太生物科技有限公司；TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃18检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗TLR4、NF⁃κB p⁃p65、NF⁃κB p65 多克隆抗体购自美国Protein Tech公司；抗β⁃actin 抗体购自中国博奥森生物有限公司。

1.3 仪器 GG⁃2000 型电子天平（常熟双杰测试仪器厂）；HGM⁃114 型血糖仪［欧姆龙医疗器械（北京） 有限公司］；GF⁃D800 型半自动生化分析仪（山东高密彩虹分析仪器有限公司）；ELX 型全自动酶标仪（美国Bio Tek 公司）；LF型蛋白电泳及转移仪（北京龙方科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 SD 大鼠适应性喂养3 d，腹腔注射STZ （60 mg／kg） 复制糖尿病大鼠模型。72 h后，测空腹血糖 （fasting blood glucose，FBG） 水平，当FBG ≥16.7 mmol／L时，判断为糖尿病模型成功建立。按体质量将成模大鼠随机分模型组及汉黄芩苷高、中、低剂量组，另设正常组，每组10 只。汉黄芩苷高、中、低剂量组每天以40、20、10 mg／kg 灌胃给药，1 次／d，正常组及模型组大鼠灌胃等体积的0.5% CMC⁃Na，连续8 周。

2.2 标本收集及指标测定 实验结束后，收集各组大鼠24 h 尿量，采用免疫比浊法检测UmAlb 水平；乙醚麻醉大鼠后行股总动脉采血，葡萄糖氧化酶法检测FBG 水平，放射免疫法检测INS 水平。血清Scr、BUN 水平及TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃18 水平采用ELISA 法测定，操作步骤按试剂盒说明书指南进行。

2.3 HE 染色 将已经固定好的肾脏组织制成3 μm 厚的石蜡切片，先后经脱蜡、浸水、苏木精染色、伊红染色、脱水及二甲苯透明等步骤后，在光镜下观察各组大鼠肾组织病理形态改变情况。

2.4 Western blot 检测 取100 mg 肾脏组织，用组织蛋白裂解液500 μL 进行匀浆处理；离心后分离上清液，BCA 法测肾组织蛋白浓度。加上样缓冲液，煮沸变性，蛋白分离采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法。经转膜、封闭及TBST 洗膜后，加入相应的TLR4、NF⁃κB p⁃p65 及NF⁃κB p65 多克隆抗体，均为1 ∶2 000 稀释，在4 ℃条件下孵育过夜。常温下，继续加入二抗孵育1 h；化学发光法显色，曝光并经图像分析软件处理，与内参蛋白β⁃actin 比较，计算目的蛋白相对表达量。

2.5 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以（） 表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠一般状态、体质量及肾脏指数的影响 在为期8 周的给药过程中，正常组大鼠精神状态较佳，摄入食、水量及大小便均正常，自如移动，反应迅速，皮毛顺滑；与正常组比较，模型组大鼠精神状态较差，出现典型的多饮、多食、多尿的症状，活动量明显减少，反应迟缓，毛色暗淡，皮毛失去光泽；经汉黄芩苷（40、20、10 mg／kg） 治疗8 周后，与模型组比较，各给药组大鼠多饮、多食、多尿症状有一定程度的改善，精神状态也有好转。如表1 所示，与正常组比较，模型组大鼠体质量降低，而肾脏指数升高（P＜0.01）；与模型组比较，汉黄芩苷组大鼠体质量升高（P＜0.01），而肾脏指数降低（P＜0.01）。

表1 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠体质量及肾脏指数的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.2 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠FBG、INS 水平均升高（P＜0.01）；经汉黄芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治疗8 周后，与模型组比较，各给药组大鼠FBG、INS 水平均降低（P＜0.01），见表2。提示汉黄芩苷可以降低糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平，具有抗糖尿病作用，且该作用呈明显的剂量依赖关系。

表2 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影响（， n＝10）

表2 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.3 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾功能相关指标的影响 与正常组比较，模型组大鼠UmAlb 水平及血清Scr、BUN 水平均升高（P＜0.01）；经汉黄芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治疗8 周后，与模型组比较，各给药组大鼠UmAlb水平及血清Scr、BUN 水平均降低（P＜0.01），见表3。

表3 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾功能相关指标的影响（， n＝10）

表3 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾功能相关指标的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.4 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾组织病理形态的影响 如图1 所示，正常组大鼠肾脏无纤维组织增生及基底膜增厚，系膜细胞和基质无增殖，肾小球和肾小管及间质结构正常，肾组织结构清晰完整、形状规则；模型组大鼠可见胞外基质增生，系膜细胞增殖，系膜扩张，肾小球肥大和肾小球基底膜增厚，部分肾小管萎缩等现象。汉黄芩苷各给药组与模型组比较，病理形态均有一定程度的改善，其中汉黄芩苷（40 mg／kg） 效果最好，改善最为明显。

3.5 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18 水平均升高（P＜0.01）；经汉黄芩苷（40、20、10 mg／kg） 治疗8 周后，与模型组比较，各给药组大鼠TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），见表4。此结果可初步说明，汉黄芩苷可抑制糖尿病模型大鼠血清中细胞炎症因子的表达，通过减轻炎症反应缓解糖尿病模型大鼠的肾脏损伤。

图1 各组大鼠肾组织病理形态（HE，×40）

3.6 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾组织TLR4／NF⁃κB 信号通路的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织TLR4、NF⁃κB p⁃p65 蛋白表达均升高（P＜0.01），而NF⁃κB p65 蛋白表达无变化 （P＞0.05）；经汉黄芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治疗8 周后，与模型组比较，各给药组大鼠TLR4、NF⁃κB p⁃p65 蛋白表达均降低（P＜0.01），而NF⁃κB p65 蛋白表达无变化（P＞0.05），见图2、表5。此结果可进一步说明，汉黄芩苷可抑制糖尿病模型大鼠肾组织TLR4、NF⁃κB p⁃p65 蛋白表达，通过调节TLR4／NF⁃κB 信号通路发挥肾脏保护作用。

表4 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18 水平的影响（， n＝10）

表4 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18 水平的影响（， n＝10）

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

图2 Western blot 法检测TLR4／NF⁃κB 信号通路相关蛋白表达

表5 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾组织TLR4／NF⁃κB 信号通路的影响（， n＝10）

表5 汉黄芩苷对糖尿病模型大鼠肾组织TLR4／NF⁃κB 信号通路的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

4 讨论

DN 是由肾脏供血的毛细血管受到损伤而导致的一种炎症性疾病，降低血清中的炎症因子TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18等的水平有利于DN 的治疗［8］。TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18 等炎症因子的表达与肾小球滤过率变化、内皮通透性改变、血流动力学降低、单核巨噬细胞聚集等密切相关［9］。既往研究［10］表明，汉黄芩苷能在转录水平通过抑制佛波酯诱导的人单核THP⁃1 细胞中Nod 样受体蛋白3 及IL⁃1β 的表达发挥抗炎作用。此外，汉黄芩苷也可以通过降低TNF⁃α、IL⁃6等的表达，抑制脂多糖诱导的巨噬细胞RAW264.7 炎症反应［11］。本研究结果发现，与模型组比较，汉黄芩苷各组大鼠TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃18 水平均明显降低，提示汉黄芩苷可抑制糖尿病模型大鼠血清中细胞炎症因子的表达，通过减轻炎症反应缓解糖尿病模型大鼠的肾脏损伤。

TLR4／NF⁃κB 信号通路在各种炎症因子相互作用和相互影响的复杂网络中起着中心调控作用。Toll 样受体可激活多种细胞因子，其位于NF⁃κB 信号通路的上游，进而诱发一系列炎症反应［12］。在DN 发展过程中，作为激活炎症信号通路中的重要调节分子TLR4 和NF⁃κB，其过度活化或表达水平上调，是诱发糖尿病肾损伤的重要分子机制［13］。汉黄芩苷可以抑制脂多糖诱导的急性肺损伤，其机制与抑制TLR4 介导的NF⁃κB 炎症信号通路中IκB 和NF⁃κB p65 蛋白的磷酸化表达有关［14］。本研究结果发现，与模型组比较，汉黄芩苷各组大鼠TLR4、NF⁃κB p⁃p65 蛋白表达均明显降低，提示汉黄芩苷可抑制糖尿病模型大鼠肾组织TLR4、NF⁃κB p⁃p65 蛋白表达，通过调节TLR4／NF⁃κB 信号通路发挥肾脏保护作用。

综上，汉黄芩苷具有抑制炎症因子表达及调控TLR4／NF⁃κB 信号通路的作用，该作用是发挥保护糖尿病模型大鼠肾组织损伤功能的重要机制。