刘宜峰 杨 华 曹 磊 郑杨杨

（海南省中医院中医内科， 海南海口570203）

食管癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一，在过去的几十年里，食管癌发病率急剧上升。尽管食管癌患者的管理和治疗有所改善，但总体的5 年生存率（10%） 和5 年食管癌切除术后生存率（15%～40%） 仍然很差［1］。因此，寻找更有效和合适的治疗剂，以改善食管癌患者的存活是十分必要的。款冬花药材是菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，具有润肺下气、止咳化痰的功效，可用于治疗新久咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血［2］。作为款冬花的活性成分之一，款冬花多糖具有抗肿瘤作用［3］，能够抑制肺腺癌的增殖，诱导其凋亡［4］。然而，款冬花多糖对食管癌的影响鲜有报道。microRNA 是一类内源性非编码RNA，在食管癌等多种癌症中异常表达［5⁃6］。miR⁃99a 被广泛报道在多种癌症中具有抑癌作用。miR⁃99a 的表达在子宫内膜癌组织中被显著抑制，miR⁃99a 过表达抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和体内肿瘤生长，阻断G1／S 期转变，诱导细胞凋亡。通过miR⁃99a 抑制PI3K／Akt／mTOR 信号通路，抑制子宫内膜癌的发展［7］。在 101 例食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC） 手术组织样本和3 个细胞系中，证实了miR⁃99a／100 的下调，miR⁃99a 和miR⁃100 的过表达通过诱导细胞株凋亡，抑制细胞增殖［8］。PI3K／Akt／mTOR 通路在细胞生物学中具有重要的调控作用，包括翻译、转录和自噬，该通路的失调参与食管癌的发病机制、发展、预后［9］。姜黄素通过上调miR⁃145 表达和抑制PI3K／Akt／mTOR 通路抑制喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞周期阻滞和凋亡［10］。姜黄素的干预可以抑制视网膜母细胞瘤SO⁃Rb50 和Y79 细胞的存活、菌落形成、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡，其对视网膜母细胞瘤的抗肿瘤活性是通过上调miR⁃99a，从而抑制JAK／STAT 通路来实现的［11］。姜黄素上调miR⁃99a 表达，抑制视网膜母细胞瘤的发生发展，但是关于款冬花多糖是否通过调控miR⁃99a、PI3K／Akt 信号通路来影响食管癌的增殖、迁移和侵袭，这方面的资料鲜见报道。因此，本研究以食管癌细胞Eca109 为对象，评价款冬花多糖在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，并结合miR⁃99a 和PI3K／Akt 信号通路，探索其潜在的分子机制。

1 材料

1.1 细胞 食管癌细胞Eca109 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药物与试剂 中药款冬花（批号1903203） 由海南寿南山参业有限公司生产，海南新星参茸药业有限公司供货；RPMI⁃1640 培养基（批号31870082） 购自美国Gibco 公司；胎牛血清（批号SH30396） 购自美国Hyclone 公司；RIPA裂解液 （批号 R0278）、噻唑蓝 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） （批号M2128） 购自美国Sigma 公司；Matrigel 基质胶（批号356234） 购自美国BD 公司；β 肌动蛋白（β⁃actin） 抗体 （批号4970）、基质金属蛋白酶2（Matrix metalloprotease 2，MMP2） （批号4022）、基质金属蛋白酶9 （Matrix metalloprotease 9，MMP9） （批号3852）、细胞周期蛋白D1 （Cyclin D1） （批号2978）、磷酸化磷脂酰肌醇⁃3 激酶（p⁃PI3K） （批号17366）、磷酸化蛋白激酶B （p⁃Akt） （批号4058） 抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记二抗（批号ZDR⁃5306） 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Tris⁃HCl⁃Tween 缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）（批号C520009⁃0500） 购自上海生工生物工程公司；TRIzol（批号15596026）、Lipofectamine 2000 （批号11668019） 购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒（批号4366596） 购自美国Thermo Fisher 公司，miR⁃con、miR⁃99a、anti⁃miR⁃con、anti⁃miR⁃99a 购自上海吉玛生物公司。

2 方法

2.1 款冬花多糖制备 款冬花药材粉碎成粉末，取过60目筛的药材粉末，按赵鹏等［12］的方法超声提取款冬花多糖。料液比1 ∶27，温度68 ℃，时间36 min，提取3 次。采用苯酚⁃硫酸法进行测定，多糖提取率＝ （款冬花多糖质量／款冬花药材质量） ×100%，多糖提取率为1.97%。

2.2 细胞培养与分组 Eca109 细胞加入RPMI⁃1640 培养基（含10%胎牛血清），在37 ℃、3% CO2培养箱中培养。待细胞生长至80%融合度时，胰酶消化3～5 min，以1 ∶2 的比例接种传代。将Eca109 细胞随机分为对照组（不加任何处理的Eca109 细胞）、款冬花多糖组（10、20、40、80、160 mg／L 款冬花多糖），款冬花多糖处理Eca109 细胞24 h。

2.3 MTT 法检测Eca109 细胞存活 使用胰酶消化Eca109细胞，将细胞浓度调整为5×104／mL，接种于96 孔板，培养24 h。款冬花多糖处理24 h 后，弃去原有培养液，以100 μL ／孔加入MTT 溶液（5 g／L），培养4 h，弃去原有液体，加入200 μL／孔的二甲基亚砜（DMSO），置37 ℃摇床持续10 min，上机检测细胞吸光度值（OD），检测波长设为490 nm。细胞存活率＝ ［（OD给药组／OD对照组）］ ×100%。

2.4 Transwell 法检测Eca109 细胞迁移和侵袭 Eca109 细胞迁移能力测定： 使用不含血清的RPMI⁃1640 培养基稀释细胞浓度为5×105／mL，吸取100 μL 于上室；下室加入含血清的RPMI⁃1640 培养基500 μL 作为趋化因子，培养24 h，棉签拭去未穿膜的Eca109 细胞，4% 甲醛固定，0.1%结晶紫染色，记录迁移细胞数。Eca109 细胞侵袭能力测定，取Matrigel 胶100 μL 加入不含血清RPMI⁃1640 培养基500 μL，混匀后添加50 μL 于上室，静置3～4 h，后续操作与Eca109 细胞迁移能力测定相同。

2.5 Western blot 检测MMP2、MMP9、Cyclin D1、p⁃PI3K、p⁃Akt 蛋白表达 在冰上使用RIPA 裂解液提取Eca109 细胞蛋白，蛋白加入上样缓冲液，变性后，进行10%的十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳 （Sodium dodecyl sulfate⁃polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS⁃PAGE），转至PVDF膜，之后加5%脱脂奶粉，封闭1 h。加入一抗MMP2 （1 ∶1 000）、MMP9 （1 ∶1 000）、Cyclin D1 （1 ∶1 000）、p⁃PI3K （1 ∶1 000）、p⁃Akt （1 ∶1 000），4 ℃过夜。TBST 溶液洗膜3 次，15 min／次，加入二抗（1 ∶5 000） 孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次，15 min／次，加入化学发光液避光显色，β⁃actin 作为内参蛋白，分析MMP2、MMP9、Cyclin D1、p⁃PI3K 和p⁃AKT 蛋白表达。

2.6 RT⁃PCR 检测miR⁃99a 表达 使用TRIzol 试剂提取Eca109 细胞总RNA，cDNA 的合成按照逆转录试剂盒说明书进行操作，以cDNA 为模板，进行扩增。引物序列miR⁃99a 正向 5′⁃AGAGCAACCCGTAGATCCGA⁃3′，反向 5′⁃CAGTG CAGGGTCCGAGGT⁃3′。U6 正向5′⁃GCGCGTCGT⁃GAAGCGTTC⁃3′，反向5′⁃GTGCAGGGTCCGAGGT⁃3′。miR⁃99a 的表达量以2-ΔΔCt法计算。

2.7 细胞转染 Eca109 细胞以1×105／mL 接种于6 孔板，待其70%融合时，按照Lipofectamine 2000 试剂说明书的指示，将miR⁃con、miR⁃99a、anti⁃miR⁃con、anti⁃miR⁃99a 转染入Eca109 细胞。转染anti⁃miR⁃con、anti⁃miR⁃99a 的细胞以80 mg／L 款冬花多糖处理24 h。

2.8 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，数据以（） 表示。两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用SNK⁃q 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同质量浓度款冬花多糖对Eca109 细胞存活率的影响 如表1 所示，与对照组比较，10、20、40、80、160 mg／L 款冬花多糖减少Eca109 细胞存活率（P＜0.05）。

表1 不同质量浓度款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 增殖的影响（， n＝9）

表1 不同质量浓度款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 增殖的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

3.2 不同质量浓度款冬花多糖对Eca109 细胞迁移、侵袭的影响 与对照组比较，40、80 mg／L 款冬花多糖抑制Eca109 细胞迁移、侵袭（P＜0.05），抑制Eca109 细胞中MMP2、MMP9 蛋白表达（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 Western Blot 检测MMP2、MMP9 蛋白的表达

表2 不同质量浓度款冬花多糖抑制食管癌细胞Eca109 迁移和侵袭（， n＝9）

表2 不同质量浓度款冬花多糖抑制食管癌细胞Eca109 迁移和侵袭（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

3.3 不同质量浓度款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 中miR⁃99a 表达的影响 如表3 所示，40、80 mg／L 款冬花多糖较对照组增加Eca109 细胞内miR⁃99a 的表达 （P＜0.05）。

表3 不同质量浓度款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 中miR⁃99a 表达的影响（x ±s， n＝9）

3.4 过表达miR⁃99a 抑制食管癌细胞Eca109 增殖、迁移和侵袭 如表4 所示，转染后miR⁃99a 表达高于miR⁃con 组（P＜0.05），表明成功构建过表达miR⁃99a 的Eca109 细胞。与miR⁃con 组比较，过表达miR⁃99a 降低Eca109 细胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表达（P＜0.05），减少细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 Western Blot 检测高表达 miR⁃99a 时CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白的表达

表4 过表达miR⁃99a 对食管癌细胞Eca109 增殖、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

表4 过表达miR⁃99a 对食管癌细胞Eca109 增殖、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

注：与miR⁃con 组比较，*P＜0.05。

3.5 低表达miR⁃99a 可以部分逆转款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 增殖、迁移和侵袭的影响 与对照组比较，款冬花多糖促进miR⁃99a 表达，抑制Cyclin D1、MMP2、MMP9表达，降低细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数（P＜0.05）。与款冬花多糖＋anti⁃miR⁃con 组比较，款冬花多糖＋anti⁃miR⁃99a 组减少miR⁃99a 表达 （P＜0.05），提高Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表达（P＜0.05），并增加细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数（P＜0.05）。见图3、表5。

3.6 低表达miR⁃99a 可以部分逆转款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 PI3K／AKT 信号通路的影响 与对照组比较，款冬花多糖减少Eca109 细胞中p⁃PI3K、p⁃Akt 蛋白表达（P＜0.05）；相较于款冬花多糖＋anti⁃miR⁃con 组，款冬花多糖＋anti⁃miR⁃99a 组提高Eca109 细胞中p⁃PI3K 和p⁃Akt 蛋白表达（P＜0.05）。见图4、表6。

4 讨论

图3 Western Blot 检测Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表达

食管癌是消化道常见的原发性恶性肿瘤。2018 年，按发病率（572 034 例新发病例） 和总死亡率（508 585 例死亡病例） 排名，食管癌居于全球癌症的第7 位，大约70%的病例发生于男性，全世界的发病率和死亡率在两性之间存在2～3 倍的差异［13］。按区域划分，东亚的发病率最高，中国和蒙古的发病率在世界上排名前5［13］。食管癌最常见的2 种组织学亚型为ESCC 和食管腺癌（oesophageal adeno⁃carcinoma，EAC）［14］。目前食管癌的治疗包括手术、化疗和放化疗，然而所有这些方法对该病的影响有限［15］，因此，有必要寻找新的食管癌治疗方法。本研究发现款冬花多糖对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，作用机制与调控miR⁃99a／PI3K／Akt 通路有关。

图4 Western Blot 检测p⁃PI3K 和p⁃Akt 蛋白的表达

款冬花是我国传统中药，始载于《神农本草经》，含有黄酮类、多糖类、生物碱类、酚酸类等化学成分［16］。款冬花多糖提取自款冬花，具有抗氧化［17］、抗肿瘤［18］等活性。Safonova 等［19］对Lewis 肺癌C57Bl／6 小鼠进行的实验表明，在常规顺铂／紫杉醇复合化疗中添加款冬花多糖可减轻抗肿瘤治疗引起的中性粒细胞减少，提高治疗效率；款冬花多糖对成粒细胞的刺激作用可与重组脑脊液神经源相媲美。Qu 等［20］从款冬花花蕾中分离得到一种多糖TFPB1，TFPB1 由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，比例为13 ∶13 ∶1 ∶7 ∶12；体外实验发现TFPB1能抑制非小细胞肺癌A549 细胞的增殖，诱导细胞凋亡。本研究发现，款冬花多糖明显抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭，显现出一定的抗肿瘤作用，这些发现提供了一种治疗人类食管癌的潜在策略。

表5 低表达miR⁃99a 可以部分逆转款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 增殖、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

表5 低表达miR⁃99a 可以部分逆转款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 增殖、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与款冬花多糖＋anti⁃miR⁃con 组比较，＃P＜0.05。

表6 低表达miR⁃99a 可以部分逆转款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 中p⁃PI3K 和p⁃Akt 蛋白表达的影响（， n＝9）

表6 低表达miR⁃99a 可以部分逆转款冬花多糖对食管癌细胞Eca109 中p⁃PI3K 和p⁃Akt 蛋白表达的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与款冬花多糖＋anti⁃miR⁃con 组比较，＃P＜0.05。

数据显示，款冬花多糖可以提高Eca109 细胞miR⁃99a表达，猜想款冬花多糖抑制食管癌功能与调控miR⁃99a 表达密切相关。miRNA 作为癌基因或肿瘤抑制因子参与多种类型癌症的调控，在癌症的诊断和治疗中发挥关键作用。miRNA 在食管癌中的重要性也引起了越来越多的关注。然而，大多数miRNA （包括miR⁃99a） 在食管癌中的调节机制仍不清楚。miR⁃99a 在多种人类恶性肿瘤中下调，被报道为一种潜在的肿瘤抑制因子［21］。资料显示，ESCC 组织中miR⁃99a 的表达较低；过表达miR⁃99a 显著抑制ESCC 细胞增殖、迁移、侵袭和上皮⁃间质转化（Epithelial⁃Mesen⁃chymal Transition，EMT），并下调EMT 相关转录因子基质金属蛋白酶 （Matrix metalloproteases，MMPs），包括MMP2、MMP7 和MMP13，表明ESCC 中miR⁃99a 的缺失促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［22］。miR⁃99a 在非小细胞肺癌组织中下调，与非小细胞肺癌患者的晚期和肿瘤转移显著相关；miR⁃99a 过表达在体外抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内抑制肿瘤转移［23］。与正常组织和正常肝细胞比较，肝癌组织样品和细胞中miR⁃99a 表达分别显著降低，Transwell 测定结果显示miR⁃99a 可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移［24］。本实验也有同样的发现，即高表达miR⁃99a明显减少Eca109 细胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达、细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数，为miR⁃99a 的抑癌作用提供了新的证据。同时，低表达miR⁃99a 部分逆转款冬花多糖对细胞增殖、迁移、侵袭、Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表达的抑制作用，说明款冬花多糖可能通过上调miR⁃99a 表达来发挥食管癌抑制作用。

PI3K／Akt 通路在多种人类癌症中被激活，并在其发生发展过程中发挥重要作用，如ESCC［25］。PI3K／Akt 信号通路参与食管癌的发生发展，抑制其活性可以有效抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭［26⁃28］。款冬花多糖TFPB1 下调p⁃Akt 和Bcl⁃2 的表达，上调caspase⁃3、Bax 等蛋白的表达，TFPB1 的抗增殖和抗凋亡作用部分依赖于Akt 信号通路的抑制［20］。miR⁃99a 过表达部分通过抑制PI3K／Akt／mTOR 通路活性诱导子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的抑制作用和细胞凋亡［7］。本研究中，款冬花多糖明显抑制p⁃PI3K 和p⁃Akt蛋白表达，这种抑制作用被低表达miR⁃99a 部分逆转，说明PI3K／Akt 信号通路影响食管癌进程，调控miR⁃99a 表达并抑制PI3K／Akt 信号通路活性可能是款冬花多糖抑制食管癌的重要途径之一。

总之，目前的结果证明了款冬花多糖的抗食管癌特性。此外，款冬花多糖显著增强miR⁃99a 表达，并进一步抑制／PI3K／Akt 信号传导。