顾志荣 薛春苗* 曹俊岭 葛 斌 杨文华潘 霖

（1.甘肃省人民医院药剂科， 甘肃兰州730000； 2.北京中医药大学东直门医院药学部， 北京100700；3.北京中医药大学东方医院药学部， 北京100078）

锁阳来源于锁阳科植物锁阳Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉质茎，多寄生于蒺藜科白刺属植物根部，资源主要分布在内蒙古、甘肃、新疆、青海等西北地区的沙漠及半沙漠地带［1］。锁阳是常用中药、蒙药及功能保健食品原料，其防治疾病与保健功能均受到人们的广泛关注与青睐。锁阳含有黄酮、多酚、三萜、多糖等成分，具有调节性激素水平［2］、增强生殖功能［3］、保护神经损伤［4］、抗氧化［5］、抗骨质疏松［6］、抗前列腺增生［7］、增强免疫［8］等多种药理作用。

锁阳富含有Zn、Fe、Ca、Mn、K、Se 等对人体健康、生长发育和疾病防治有益的元素，同时也含有Pb、Cd、Cr、As、Hg 等对人体有害的重金属元素［9］。文献检索发现，锁阳作为沙生药用植物，其无机元素／重金属富集规律及其与产地环境的关联性研究尚未开展，无机元素的产地分布规律、综合质量控制与评价、健康风险评估等相关报道较少，仅有10 余年前的无机元素含有量测定研究［9⁃10］，但因生长环境及气候条件变化等原因，其参考价值有限。鉴于此，本研究基于多产地、大样本分析锁阳无机元素的产地分布规律，建立其元素指纹图谱，确定特征性无机元素，以期为锁阳的安全用药及综合质量控制与评价提供参考。

1 材料

1.1 药材 65 批锁阳药材，采集于甘肃、内蒙古、新疆、青海、宁夏等5 个省 （区），包括酒泉、敦煌、武威、张掖、阿拉善左旗、阿拉善右旗、石嘴山、和田、喀什、阿勒泰、海南、海西等12 个市／区／州／旗，所有样品均经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定为Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉质茎。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.2 仪器与试剂 iCAP RQ 型ICP⁃MS 仪（美国赛默飞世尔公司）；ETHOS 900 微波消解系统（意大利迈尔斯通公司）；Milli⁃Q 超纯水装置（法国密理博公司）；BT 125D 电子天平（万分之一，德国赛多利斯集团）。

钠（Na）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、铁（Fe）、锌（Zn）、锰（Mn）、钴（Co）、锶（Sr）、镍（Ni）、银 （Ag）、钡 （Ba）、钛 （Ti）、铅（Pb）、铬（Cr）、镉（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu） 等单元素标准溶液，质量浓度均为1 000 μg／mL，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心；锗 （Ge）、铟 （In）、铋 （Bi）、钪（Sc） 等单元素内标液，质量浓度均为10 μg／mL，购于美国SPEX Certiprep 公司。柑橘叶标准物质（批号GSB⁃11），购于中国地球物理化学勘察研究所。HNO3和H2O2均为优级纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 内标液 精密移取Ge、In、Bi、Sc 各单元素内标液适量，置于100 mL 量瓶中，以去离子水稀释成1 μg／mL 的混合内标液。

2.1.2 对照品溶液 精密量取各单元素标准溶液适量，用2%HNO3溶液，将Na、K、Ca、Mg、Fe元素制备成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg／L 的系列混合对照品溶液；将Zn、Mn、Co、Sr、Ni、Ba、Ti、Pb、Cu 元素制备成质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg／L 的系列混合对照品溶液；将As、Ag、Cr、Cd、Hg 元素制备成质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg／L 的系列混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液 取本品粉末（已过80 目筛）约0.5 g，精密称定后置于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入8 mL HNO3和2 mL H2O2，摇匀，静置至气泡散尽，置微波消解系统内消解。微波功率为1 000 W，在20 min 内温度由室温升至200 ℃，200 ℃维持20 min，待消解完全后冷却至室温。取出消解罐，在通风橱中将酸挥尽，将消解液转移至50 mL 量瓶中，以去离子水洗涤消解罐与盖子各3次，洗液合并于量瓶中，以去离子水稀释至刻度即得。同时、同法制备空白溶液和标准参照物溶液。

2.2 ICP⁃MS 条件 等离子体射频功率1 300 W；雾化气体积流量（氩气） 1.1 L／min；辅助气体积流量1.0 L／min；等离子流体积流量15 L／min；雾化室为石英双通道，雾化室温度2 ℃；采样锥孔径1.1 mm；截取锥孔径0.4 mm；采样深度7.0 mm；脉冲电压为1 050 V；蠕动泵转数为40 r／min；炬管为石英一体化，2.5 mm 中心通道；驻留时间30 s；动能歧视（KED） 电压3 V。重复测定3 次取平均值。

2.3 样品含有量测定 相对分子质量小于100 的元素 Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Sr、Ni、Ti、As 采用Ge 作为内标，相对分子质量大于100 的元素Ag、Ba、Pb、Hg、Cd 采用In作为内标。对样品进行检测时，内标进样管需一直置于内标溶液中，同时样品管需插入质量浓度由低到高的对照品溶液中，依次进行测定。

由于锁阳中各元素的含有量差异悬殊，故测定Na、K 时稀释至1／1 000 进行测定，测定Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Co、Sr 时稀释至1／100 进行测定，测定Cu、Ti 时稀释至1／10 进行测定。采用外标标准曲线法求取样品中各元素含有量。

2.4 不同产地锁阳无机元素含有量比较 将测定结果按市级产地表示为（） 的形式，采用方差分析（ANOVA） 进行两两比较，结果见表2。可知，不同产地锁阳无机元素含有量在一定程度上显示了产地间差异性，并且含有量分布没有明显的地域性聚集特征，其中尤以Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co、Ti、Cd、Hg 等9 种元素在不同产地间的含有量变异较大。

表2 不同产区样品无机元素含有量比较（，μg／g）Tab.2 Comparison of inorganic element contents in samples from different origins （，μg／g）

表2 不同产区样品无机元素含有量比较（，μg／g）Tab.2 Comparison of inorganic element contents in samples from different origins （，μg／g）

续表2

2.5 元素指纹图谱建立及相似度分析 为直观比较锁阳中19 种元素含有量的分布趋势，本实验将所有元素扩大或缩小至同一数量级，其中Na、K缩小1 000 倍，Ca、Mg、Fe 缩小100 倍，Zn、Mn缩小10 倍，Ag、Cr、Cd、As 扩大10 倍，Hg 扩大100 倍，其余元素不作改变。将各元素按原子序数由小到大排列，以元素种类为横坐标、调整后的相对含有量为纵坐标绘制含有量的分布曲线［11］，得到锁阳无机元素指纹图谱，见图1。可以直观看出，锁阳元素指纹图谱的峰型与走势基本一致，但清楚可见部分样品的峰型存在特异性且相对含有量差异明显。

分别以平均数法和中位数法求取对照图谱，再分别采用“夹角余弦法”［12］“相关系数法”［13］计算指纹图谱相似度，见表3。65 批锁阳中，有49批的夹角余弦值＞0.9，26 批的夹角余弦值＜0.9，39 批的相关系数＞0.8，36 批的相关系数＜0.8。表明，部分产地锁阳样品的峰型特异性明显，相对含有量差异较大。

图1 锁阳无机元素指纹图谱Fig.1 Inorganic elemental fingerprints of C.songaricum

2.6 无机元素主成分分析 以锁阳中19 种无机元素含有量为变量进行主成分分析，主成分分析前先对元素含有量数据进行标准化。结果共提取了5 个主成分（PC1～PC5），主成分分析特征值及贡献率见表4，投影图见图2。主成分分析累积贡献率达到87.533%，能够反映整体变量的主要特征。由主成分分析投影图可知，主成分分析可基于锁阳中19 种无机元素含有量，对锁阳样品进行省级产地的分类鉴别，从而确定锁阳的省级产地分布轮廓。其中，Ⅰ类是甘肃产锁阳，Ⅱ类是青海产锁阳，Ⅲ类是内蒙古产锁阳，Ⅳ类是新疆产锁阳；第1 象限主要为甘肃张掖、武威产锁阳，第2 象限主要为甘肃酒泉、敦煌产锁阳。同时发现，不同产地锁阳的区分界线不甚明确，离群样本较多；并且，主成分分析未能对宁夏产锁阳进行识别，也无法完全确定锁阳无机元素的市级产地分布轮廓。

表3 65 批样品相似度Tab.3 Similarities of sixty⁃five batches of samples

表4 主成分特征值及贡献率Tab.4 Eigenvalues and contribution rates of principal components

图2 样品主成分分析投影图Fig.2 Scatter plot of samples by principal component analysis

2.7 基于载荷分析的特征性元素分析 采用载荷分析通过“降维” 原理识别锁阳的特征性无机元素［14］，见图3。载荷图表示各元素对主成分综合作用的贡献，每个点代表一种元素，距离原点越远表示权重越大，即该元素对整体质量的贡献越大。图中红色的点所代表的元素，其变量重要性投影值（VIP） 大于1，表明该元素对整体质量的贡献度高于平均水平。可知，载荷图中VIP 值大于1 的元素为Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co，这些元素是影响锁阳无机元素整体组成的波动性元素，因此是锁阳的特征性无机元素，可作为其质量控制与评价的参考之一。

图3 无机元素主成分载荷图Fig.3 Loading plot of inorganic elements

2.8 无机元素间相关性分析 结果见表5。显示锁阳中的元素Ca⁃Cu、Fe⁃Ag、Co⁃Ba、Na⁃Mn 均呈正相关 （P＜0.05），Mg⁃Zn、Mn⁃Cd、Pb⁃Cr、K⁃Ba、K⁃Cr 均呈负相关（P＜0.05）。在锁阳对无机元素的吸收累积过程中，呈正相关的元素间存在着协同促进的作用，而呈负相关的元素则存在着相互拮抗作用［15］。

3 讨论

2015 年版《中国药典》 对中药材中重金属元素的限度规定为，Pb≤5.0 μg／g，Cd≤0.3 μg／g，Cr≤2.0 μg／g，As ≤2.0 μg／g，Hg ≤0.2 μg／g，Cu≤20.0 μg／g［16］；我国外贸部制定的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》 （WM2⁃2001） 中规定与之相同，但未对Cr 作出规定，同时规定了重金属总量≤20.0 μg／g［17］。与国家标准对比可知，甘肃酒泉、新疆喀什、青海海南等3 个产地锁阳中Cd 元素超标，分别为（0.330±0.108）、（0.387±0.307）、（0.399±0.146） μg／g；其余各产地样品中各种重金属元素及重金属总量均符合相关规定。

表5 样品中无机元素的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of inorganic elements in various samples

当前，有机成分是中药材质量控制与评价普遍采用的指标，而无机元素主要从安全性角度对Pb、Cd、As、Hg、Cu 等有害重金属进行控制［18］，而对其他无机元素并未足够重视。方差分析证实，Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co、Ti、Cd、Hg 元素含有量在不同产地间的变异较大，而载荷分析进一步发现Ca、Mn、Ni、Zn、Co、Cu 元素是锁阳的特征性无机元素。Ca 参与人体神经、骨骼、肌肉代谢，并维持正常神经肌肉兴奋性，被誉为“人体生命之本”。超氧化物岐化酶（SOD） 是人体抗氧化损伤的重要保护酶，Zn、Mn、Cu 对SOD 的活性及稳定性具有重要作用［19］。另一方面，目前研究认为Zn／Cu 比值与补肾中药的补肾助阳作用密切相关［20］。Ni 与Co 均有促进造血功能的作用，贫血病人血Ni、Co 含有量减少，同时Fe 吸收减少，而补充Ni、Co 后红细胞、血红素及白细胞均增加，并且Co 能通过组成维生素B12 来参与机体生理活动［21］。可见，本研究所筛选的Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co 等锁阳的特征性元素，与其补肾助阳、抗氧化、抗衰老、提高免疫等生物作用密切相关，具有明确的科学依据及指向性。

相似度分析表明，部分产地锁阳样品的峰型特异性明显，相对含有量差异较大，但这些样品的产地分布没有明显的地域性聚集特征，而主成分分析可以进一步对锁阳样品进行省级产地的分类鉴别，从而确定锁阳的省级产地分布轮廓［22］。而另一方面，主成分分析无法完全确定锁阳无机元素的市级产地分布轮廓，其原因可能与锁阳的产地分布范围广阔，东西跨度大，环境因素差异大有关。

此外，锁阳中的元素Ca⁃Cu、Fe⁃Ag 呈显著正相关，提示人们在获取Ca、Cu、Fe、Ag 等元素作为正常补充和调节机体的同时，应注意Cu、Ag 的过度获取对机体造成伤害。