王子怡 李艳荣 杜义龙 赵胜男 潘海峰

（承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室， 河北承德067000）

山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br.或山楂Cra⁃taegus pinnatifidaBge.的干燥叶［1］。山楂叶主要成分为三萜和黄酮类，以山楂叶总黄酮类研究较多见［2⁃3］。目前，关于山楂叶的研究多集中在药理作用［4⁃6］和药材的指纹图谱［7］及多组分含有量测定［8⁃9］等方面，关于山楂叶标准汤剂的研究报道较少。

中药标准汤剂作为一种标准体系，有效地规范了临床饮片形式［10］。鉴于中药大多具有化学成分复杂，且汤剂质量不能仅仅依赖简单的定性及定量，需要对标准汤剂的质量进行整体控制，指纹图谱是符合中药特点的质量控制模式之一。指纹图谱通过共有峰标定和相似度评价等较全面的体现中药的整体性［11］，多指标成分的同步测定可明确其含有量［12］。课题组前期对山楂叶指纹图谱［13⁃14］及多组分含有量测定［15⁃16］进行了系统研究，本实验在前期研究的基础上选取不同产地的16 批山楂叶制成标准汤剂，建立HPLC 指纹图谱［17⁃18］，并对5 种黄酮类成分进行含有量测定，以期为山楂叶标准汤剂质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AG⁃245 型电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；JA2003 上皿天平（千分之一，上海精密科学仪器天平仪器厂）；HC⁃2062高速离心机 （科大创新股份有限公司中佳分公司）。甲醇和乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；水（杭州娃哈哈集团有限公司）。对照品绿原酸（161217）、牡荆素葡萄糖苷（171403），均购于成都普菲得生物技术有限公司；对照品牡荆素鼠李糖苷（111668⁃2000602），购于中国食品药品检定研究院；对照品芦丁 （120226）、金丝桃苷（161231），均购于上海融禾医药科技有限公司。

山楂叶药材（存放在承德医学院中药研究所）由承德民族师范学院董建新教授鉴定为正品。信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Extend⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.2%甲酸⁃乙腈（A⁃B），梯度洗脱（0～10 min，8%B；10～20 min，15% B；20～60 min，35% B；60～70 min，60% B；70～90 min，90% B）；柱温30 ℃；体积流量0.8 mL／min；检测波长320 nm；进样量10 μL。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.2 溶液制备

2.2.1 标准汤剂 参考文献［10］，取100 g山楂叶粗粉，加蒸馏水1 200 mL 第1 次浸泡30 min后加热回流30 min，趁热过3 层纱布；残渣加入1 000 mL蒸馏水进行20 min 回流，合并2 次滤液，45 ℃减压浓缩至500 mL，即得绿色或棕色质量浓度为0.2 g／mL的标准汤剂，可在-41 ℃冷冻干燥至粉末状。

2.2.2 供试品溶液 取经过超速离心10 min 处理的2 mL 山楂叶标准汤剂与16%乙腈1 ∶1混合溶液的上清液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，取续滤液，即得。

2.2.3 混合对照品溶液 甲醇溶解对照品，分别制得含各对照品0.717、0.723、1.05、1.103、1.100 mg／mL 作为贮备液。精密制备含绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、芦丁、金丝桃苷分别为286、286、840、264、176 μg／mL 的混合对照品溶液。

2.3 指纹图谱建立

2.3.1 方法学考察

2.3.1.1 精密度试验 取“2.2.2” 项下供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样6 次，测得各共有峰相对保留时间RSD 及相对峰面积RSD （牡荆素葡萄糖苷作为参照），均小于0.80%。表明仪器精密度良好。

2.3.1.2 稳定性试验 取“2.2.2” 项下供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、4、6、8、10、24 h 进样，测得各共有峰相对保留时间RSD、相对峰面积RSD 均小于2.0%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.1.3 重复性试验 取6 份S4 山东东营批次供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，测得各共有峰相对峰面积RSD 及相对保留时间RSD 均小于1.0%。表明该方法重复性良好。

2.3.2 指纹图谱建立 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版” 对HPLC 所得色谱图进行处理，以山东泰安样品的色谱图为参照，建立山楂叶标准汤剂HPLC 指纹图谱色谱叠加图，对照图谱以中位数法生成。见图1。

图1 16 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of sixteen batches of samples

2.3.3 相似度分析 相似度分析结果见表2。

表2 16 批样品相似度Tab.2 Similarities of sixteen batches of samples

2.4 数据分析

2.4.1 主成分分析 本实验通过SPSS 21.0 进行主成分分析，并对18 个共有峰的峰面积进行标准化处理。以3 个主成分分别作为X、Y、Z轴，通过投影可得到16 批山楂叶标准汤剂主成分分析图，见图2。16 批山楂叶标准汤剂分为3 类，S1 批为一类，S3 和S7 批为一批，其他为另一批。

图2 16 批样品主成分分析图Fig.2 Principal component analysis plot for sixteen batches of samples

2.4.2 聚类分析 本实验以18 个共有峰为变量，采用SPSS 21.0 组间连接平方Euclidean 距离的聚类方法，进行聚类分析。结果见图3。以类间距为指标，在15～25 之间，S1 为一类，其余批次为一类；10～15 之间时S7 批单独成一类；0～8 时S3 为一类，其他为一类。

图3 16 批样品聚类树状图Fig.3 Dendrogram of sixteen batches of samples

2.4.3 共有峰模式建立 通过化学模式识别研究，从16 批山楂叶药材中筛选出S2、S4、S5、S6、S08～S16 共13 批药材较稳定，可用于山楂叶标准汤剂的质量控制。将这13 批色谱图进行相似度分析，建立了13 批样品的指纹图谱共有模式，见图4，共标定出21 个共有峰，相似度均大于0.95。见图5。

图4 13 批样品HPLC 指纹图谱共有模式Fig.4 Common pattern of HPLC fingerprints of thirteen batches of samples

图5 山楂叶标准汤剂指纹图谱共有模式Fig.5 Common pattern of fingerprint of hawthorn leaves standard decoction

2.4.4 共有峰指认 取“2.2.3” 项下混合对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，所得色谱图与对照图谱中的色谱峰进行指认并标定，共标定了5 个共有峰，见图6。

图6 各成分HPLC 色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of various constituents

2.5 样品含有量测定

2.5.1 方法学考察

2.5.1.1 线性关系考察 精密量取“2.2.3” 项下贮备液，制备含5 种对照品分别为286、286、840、264、176 μg／mL 的混合对照品溶液，依次稀释得系列质量浓度溶液，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.1.2 精密度试验 取山东潍坊批次供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次，进样量10 μL，测得各成分峰面积RSD 均小于2.0%。表明仪器精密度良好。

2.5.1.3 稳定性试验 取山东潍坊批次供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、12、24 h 进样，测得各成分含有量RSD 均小于1.5%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.1.4 重复性试验 取山东潍坊批次供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，测得各成分含有量RSD 均小于1.0%，表明该方法重复性良好。

2.5.1.5 加样回收率试验 取已知含有量的山东潍坊批次标准汤剂6 份，每份约500 μL，分别精密加入相当于500 μL 标准汤剂中5 种指标成分含有量的对照品，用水稀释至1 mL。加入1 mL 16%乙腈测定，计算得5 种成分的平均回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.5.2 样品含有量测定 取各批次标准汤剂，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，对16 批供试品溶液含有量进行测定，结果见表5。

3 讨论与结论

3.1 色谱条件优化 本实验考察了色谱柱Agilent ZORBOX⁃SB C18及Agilent Extend C18，选择了分离效能最佳的Agilent Extend C18；考察了流动相不同组成及不同浓度甲酸对分离效果的影响，流动相0.2%甲酸水⁃乙腈分离效果较好，最终确定“2.1”项下色谱条件。

3.2 结果分析 16 批次山楂叶标准汤剂绿原酸含有量为0.027 9%～0.098 3%；牡荆素葡萄糖苷含有量为0.069%～0.156%；山东⁃3 潍坊批次的牡荆素鼠李糖苷含有量为1.793%，而山东泰安批次含有量仅为0.126%；芦丁含有量为0.036%～0.187%；辽宁批次标准汤剂金丝桃苷含有量为0.115%，山东泰安批次金丝桃苷含有量为0.001%。山楂叶道地产区承德的5 种黄酮类成分较稳定；不同批次山东山楂叶标准汤剂成分有差异，可能与山楂叶采收时期不同、栽培方法等有关，后续可以对同一地区不同采收时期的山楂叶标准汤剂进行相应研究。

表5 各成分含有量测定结果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents （%）

现今关于中药饮片标准汤剂的研究多是标准汤剂的制备，指纹图谱及其质量研究。后续可以对饮片标准汤剂的药理活性、谱效关系等进行相应研究。