唐保露 郑宇辰 张叶明 袁 萍 戚小宇 张 旭 杨解人 郑书国

（1.皖南医学院药理学教研室， 安徽芜湖241002； 2.皖南医学院临床医学院， 安徽芜湖241002；3.皖南医学院药学院， 安徽芜湖241002； 4.皖南医学院定量药理研究所， 安徽芜湖241002）

2 型糖尿病是一种以胰岛素抵抗、高血糖和胰岛β 细胞功能障碍为特征的代谢性疾病，其病因复杂，其中肥胖是最主要危险因素之一［1］。大多数肥胖人群血浆游离脂肪酸水平明显升高，高水平脂肪酸对胰岛β 细胞可产生明显毒性作用，并可诱导机体发生胰岛素抵抗［2］。短期暴露于高浓度游离脂肪酸，可使胰岛素分泌代偿性增加，而时间过长则导致胰岛β 细胞功能损伤，甚至发生凋亡［3］。胰岛β 细胞数量减少及功能损伤是发生糖尿病的主要机制之一［4］。因此抑制游离脂肪酸诱导的胰岛功能损伤和β 细胞凋亡是防治2 型糖尿病的重要措施之一。

糖尿病属于中医“消渴” 范畴，其发生发展与脾胃关系密切，其中脾气亏虚是糖尿病发病的重要病机，“脾虚致消” “健脾愈消” 已成为中医治疗糖尿病的重要理论依据之一，临床以益气健脾方治疗2 型糖尿病也取得较好疗效［5⁃6］。四君子汤是益气健脾的经典方剂，由党参、白术、茯苓和甘草组成，临床用于治疗糖尿病取得了良好的效果［7］，但对其改善2 型糖尿病的确切机制，目前仍不清楚。前期研究［8］发现，四君子颗粒可明显改善高糖高脂饮食诱导的大鼠糖尿病前期状态，减少胰岛细胞凋亡。本研究采用体外培养的小鼠胰岛β 细胞株（MIN6 细胞），应用血清药理学方法观察四君子汤对棕榈酸诱导的MIN6 细胞损伤和凋亡的影响，并从内质网应激角度探究其可能机制。

1 材料

1.1 动物 30 只SD 大鼠购于浙江省实验动物中心，生产许可证号SCXK （浙） 2014⁃0001。

1.2 药物与试剂 四君子颗粒（李时珍医药集团有限公司，批号20180516）；MIN6 细胞株（上海博古生物科技有限公司）；DMEM 培养基（批号AD12854263）、胎牛血清（批号MKF0602） 购自美国 HyClone 公 司；棕 榈 酸 钠 （批 号SLBQ0242V）、β⁃巯基乙醇（批号STBJ3747） 购自美国Sigma 公司；细胞凋亡检测试剂盒 （货号BB18061）、细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒（货号BB18061X） 购自上海贝博生物科技有限公司；葡 萄 糖 调 节 蛋 白⁃78 （GRP78，批 号120617180313）、ATF4 抗体（批号011018180606）购自碧云天生物技术有限公司；PERK （批号66r8853）、p⁃PERK 抗体（批号86w3361） 购自美国Affinity Biosciences 公司；CHOP 抗体 （批号57c6807） 购自美国Cell Signaling Technology 公司；β⁃actin 抗体（批号20180926） 购自博士德生物工程有限公司；ECL 发光试剂盒（批号20180822）购自上海天能科技有限公司。

1.3 仪器 二氧化碳细胞培养箱（美国SIM 公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；DYY⁃6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；Mini PROTEAN 转膜仪（美国Bio⁃Rad 公司）；Fluor chem FC3 化学发光凝胶成像系统（美国Protein Simple 公司）；Infinite 200 PRO 酶标仪（瑞士Tecan 公司）；手持式细胞计数仪（美国Millipore 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）。

2 方法

2.1 含药血清制备 30 只SD 大鼠随机分为正常对照组及四君子颗粒高、低剂量组 （10.5、5.25 g／kg），每组10 只，除正常对照组，其余2组分别灌胃给予高、低剂量四君子颗粒（10.5、5.25 g／kg），连续给药7 d。末次给药2 h 后，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，无菌条件下分离血清，56 ℃水浴灭活30 min，-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 MIN6 细胞培养 将MIN6 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中（含50 μmol／L β⁃巯基乙醇），置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中，待细胞生长至近融合时，用0.25% 胰酶消化后传代培养。

2.3 MIN6 细胞活力检测 将MIN6 细胞用0.25%胰酶消化后，制备单细胞悬液，以2×104／孔接种于96 孔培养板，24 h 后弃培养液，PBS 洗涤后加入新的培养液，细胞随机分为对照组、模型组、空白血清组及四君子颗粒高、低剂量组。四君子颗粒高、低剂量组分别加入相应的含药血清，空白血清组加入空白对照组血清，使血清终浓度为10%，孵育 24 h；除对照组外，其余各组更换含0.4 mmol／L的棕榈酸培养基，孵育24 h，CCK⁃8 法检测细胞活性。

2.4 MIN6 细胞凋亡检测 取生长状态良好的MIN6 细胞，0.25% 胰酶消化后制备单细胞悬液，接种于6 孔培养板，24 h 后更换新鲜培养液。按“2.3” 项下分组及药物处理。弃培养液，PBS 洗涤后0.25%胰酶消化收集细胞，预冷PBS 洗涤2次。用400 μL Annexin V 结合液悬浮细胞，在细胞悬液中加入5 μL Annexin V⁃FITC 染色液，轻轻混匀后于4 ℃避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液轻轻混匀，4 ℃避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡水平（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

2.5 Western blot 法检测蛋白表达 细胞接种于6孔培养板，按“2.3” 项下分组及药物处理。弃培养液，PBS 洗涤2 次，加入0.25%胰酶消化收集细胞，PIPA 裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制剂） 冰浴裂解细胞。12 000g离心15 min，收集上清液，BCA 法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。分别加入β⁃actin、GRP78、ATF4、CHOP、p⁃PERK、PERK 抗体，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，滴加ECL发光液显色，凝胶图像分析系统拍照并分析条带光密度，结果以 GPR78／β⁃actin、ATF4／β⁃actin、CHOP／β⁃actin、P⁃PERK／PERK 表示。

2.6 统计学分析 采用DAS1.0 统计软件进行分析，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 四君子颗粒对MIN6 细胞活力的影响 由图1可见，0.4 mmol／L 棕榈酸孵育MIN6 细胞24 h 后可以诱导MIN 6 细胞损伤（P＜0.01）；四君子颗粒含药血清预孵24 h 可减轻棕榈酸诱导的细胞损伤（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，空白血清组MIN 6 细胞活力差异无统计学意义。提示四君子颗粒可有效改善棕榈酸诱导的细胞损伤。

图1 四君子颗粒对棕榈酸诱导的MIN6 细胞损伤的影响（， n＝6）Fig.1 Effects of SGs on the viability of palmitic acid⁃induced MIN6 cells （， n＝6）

3.2 四君子颗粒对MIN6 细胞凋亡的影响 正常培养条件下，MIN6 细胞凋亡率很低，0.4 mmol／L棕榈酸诱导24 h 后，MIN6 细胞凋亡率升高（P＜0.01），表现为凋亡早期和凋亡晚期的细胞均增加；四君子颗粒含药血清预孵24 h 可降低棕榈酸诱导的MIN6 细胞凋亡（P＜0.01），而空白对照血清对棕榈酸诱导的细胞凋亡无明显影响，见图2。提示四君子颗粒可有效抑棕榈酸诱导的MIN6 细胞凋亡。

3.3 四君子颗粒对MIN6 细胞GRP78、ATF4、CHOP、p⁃PERK 表达的影响 由图3 可知，正常培养条件下，MIN6 细胞GRP78、ATF4 及CHOP蛋白表达较低，PERK 蛋白磷酸化也较低；0.4 mmol／L 棕榈酸诱导24 h 后，MIN6 细胞GRP78、ATF4、CHOP、p⁃PERK 蛋白表达升高（P＜0.01）；四君子颗粒含药血清预孵24 h 可降低细胞内GRP78、ATF4、CHOP、p⁃PERK 蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），而空白对照血清对GRP78、ATF4、CHOP 及p⁃PERK 蛋白表达均无明显影响，提示四君子颗粒含药血清可明显减轻棕榈酸诱导的MIN6 细胞内质网应激，这一作用与其抑制细胞凋亡作用一致，四君子颗粒抑制棕榈酸诱导的MIN6细胞凋亡与抑制内质网应激PERK⁃ ATF4⁃CHOP 信号通路有关。

图2 四君子颗粒对棕榈酸诱导的MIN6 细胞凋亡的影响（， n＝4）Fig.2 Effects of SGs on the apoptosis of palmitic acid⁃induced MIN6 cells （， n＝4）

4 讨论

流行病学资料显示，肥胖是2 型糖尿病最主要危险因素之一，糖尿病患者除表现为高血糖外，还普遍存在脂代谢紊乱，表现为血浆三酰甘油（TG）、极低密度脂蛋白（VLDL） 和游离脂肪酸等水平显著升高［9］。大量研究显示，高水平游离脂肪酸一方面可干扰胰岛素信号转导，引起胰岛素抵抗，另一方面可诱导胰岛β 细胞凋亡，导致胰岛功能受损，诱发2 型糖尿病。因此，抑制高浓度游离脂肪酸诱导的胰岛β 细胞损伤和胰岛素抵抗是防治肥胖相关2 型糖尿病的有效途径之一。本研究采用血清药理学方法，观察四君子颗粒对MIN6 小鼠胰岛 β 细胞的保护作用。结果显示，0.4 mmol／L 棕榈酸孵育24 h 后，MIN6 细胞活力明显受损，细胞凋亡明显升高，这一结果与文献报道一致［10］。四君子颗粒含药血清预孵24 h，棕榈酸诱导的MIN6 细胞损伤减轻，细胞凋亡也显著下降，而空白对照血清对棕榈酸诱导的细胞损伤和凋亡无明显影响，提示四君子颗粒含药血清可有效改善棕榈酸诱导的MIN6 细胞损伤和凋亡。

图3 四君子颗粒对棕榈酸诱导的MIN6 细胞GRP78、ATF4、CHOP、p⁃PERK 表达的影响（， n＝4）Fig.3 Effects of SGs on GRP78，ATF4，CHOP and p⁃PERK expression of palmitic acid⁃induced MIN6 cells （，n＝4）

游离脂肪酸可刺激胰岛β 细胞合成与分泌胰岛素，而长期暴露于高浓度游离脂肪酸则会加重β细胞胰岛素分泌负荷［11］。当胰岛素合成大量增加时，作为细胞内蛋白质合成与翻译后加工重要场所的内质网负担加重，大量未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内积聚，诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［12］。一旦发生内质网应激，细胞首先启动未折叠蛋白反应（unfolded protein re⁃sponse，UPR） 以缓解内质网应激，恢复内质网稳态。GRP78 合成增加是UPR 标志性事件之一［13］。本研究结果显示，暴露于棕榈酸24 h 后，MIN6 细胞GRP78 蛋白表达显著升高，说明棕榈酸诱发了明显的内质网应激。四君子颗粒含药血清预孵24 h后可明显下调细胞内GRP78 蛋白表达，而空白对照血清对GRP78 表达无明显影响，提示四君子颗粒含药血清可有效改善棕榈酸诱导的MIN6 细胞内质网应激。

生理条件下，GRP78 与内质网应激感受蛋白肌醇需求酶 1α （inositol⁃requiring enzyme 1α，IRE1α）、活化转录因子6 （activating transcription factor 6，ATF6） 和RNA⁃依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PRK like ER associated kinase，PERK） 结合而使后者处于无活性状态。当大量未折叠蛋白在内质网腔内积聚时，一方面细胞代偿性合成GRP78增加；另一方面，结合于3 种膜蛋白上的GRP78解离，转而去结合未折叠蛋白，游离出的IRE⁃1α、PERK、ATF6 进而诱发内质网应激下游信号传递及相关基因表达［13］。通过上述信号通路，UPR 可改变细胞代谢方式，促使细胞存活。但当内质网应激过于强烈或持续时间过久，UPR 无法使内质网恢复稳态时，则可诱导细胞凋亡。IRE⁃1α、PERK和ATF6 通路的活化均可上调CHOP 蛋白表达，诱导细胞凋亡，其中PERK 途径在内质网应激诱导细胞凋亡中发挥主要作用［14］。本研究结果显示，与棕榈酸孵育24 h 后，MIN6 细胞内ATF4 蛋白、磷酸化PERK 及其下游蛋白CHOP 表达均显著升高，而与四君子颗粒含药血清预孵可明显抑制上述蛋白表达，这一作用与四君子颗粒含药血清抑制MIN6细胞凋亡作用一致，提示四君子颗粒含药血清抑制棕榈酸诱导的MIN6 细胞凋亡与抑制细胞内质网应激及PERK 相关凋亡信号通路有关。

综上所述，四君子颗粒含药血清可有效抑制棕榈酸诱导的MIN6 细胞凋亡，其机制与抑制内质网应激PERK 信号通路有关。该研究结果提示，四君子颗粒防治2 型糖尿病可能与保护胰岛β 细胞、改善胰岛功能有关。