陈泽斌，李希杨，阮亚男，徐胜光

(昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214)

植物根系具有许多重要的生理功能，如吸收、合成、分泌、感知等[1]．而限根栽培是指利用一定的物理或生态方法，通过控制根系生长来控制根系的体积，以及调节地上、地下部分、营养生长和生殖生长过程的一种栽培方法[2]．目前，限根栽培技术已应用于多种果树[3]．常见的限根栽培模式有垄式、箱框式和坑式3种[4]．近年来，在美国、澳大利亚等国家推广的根域干燥和气控根系技术，也属于限根栽培模式[5]．限根栽培可以控制植物生长，促进开花，同时还可减少土壤耕作中因肥料渗漏对地下水的污染[6]．目前，关于限根栽培对植物根系温度、光合特性、生物量积累和营养品质影响的报道较多．然而有关限根栽培对植物根际土壤微生物区系的影响鲜见报道，特别是其对植物根际土壤微生物多样性的影响机理尚待阐明．因此，本研究拟在比较两种栽培方式下，探讨万寿菊根际微生物群落组成和分布，旨在为限根栽培技术增产的产量生理基础提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

供试万寿菊种子由云南省农业科学院花卉所提供．在温室内穴盘基质育苗后，于2018年5月在云南省宣威市落水镇健康试验田进行大田定植，2018年9月进行土壤样品采集及DNA的提取．

1.2 试验设计

试验设置I1A处理(CK)为非限根栽培，I1AX处理为限根栽培．非限根栽培及限根栽培参照武衍等[7]的方法进行．在采摘期，随机选择30株健康的万寿菊，挖掘出根系，采用抖根法[8]采集根际表面附着的土壤，混合后获得根际土壤样品．

1.3 土壤DNA的提取

采用DNA提取试剂盒提取．

1.4 16S rDNA的V4-5区和ITS1区的PCR扩增及回收

分别用引物515F/926R[9]和ITS1F/ITS2R[10]扩增16S rDNA的V4-5区和ITS1区．切胶回收目标片段，委托上海微基生物有限公司进行测序．

1.5 测序数据的生物信息学分析

对序列进行质控、过滤和拼接，得到有效序列[11]．对有效序列进行OTU聚类分析、物种分类学分析、多样性指数分析和测序深度检测[12]，然后对各分类水平上的群落结构进行统计分析．

2 结果与分析

2.1 细菌和真菌的OTU丰度和α多样性

根际土壤样品16S rDNA的V4-5及ITS1区的Chao1指数、辛普森指数、有效序列数、OTU丰度、香农指数和覆盖率见表1和表2．结果表明，文库覆盖了土壤样品中99.74%以上的细菌和真菌类群．OTU丰度稀释曲线的斜率随着测序数量的增加而逐渐减小(图1和图2)，表明测序量足以反映样品中的物种组成，但依然存在少量低丰度类群没有被覆盖．限根栽培后根际土壤细菌类群的辛普森指数与非限根栽培相同，香农指数和OTU丰度略低于非限根栽培，说明限根栽培对细菌类群OTU分布的均匀度无影响，且略降低了细菌OTU的丰富度．限根栽培后根际土壤真菌类群的辛普森指数、香农指数和OTU丰度均高于非限根栽培，说明限根栽培提高了真菌类群OTU分布的均匀度和丰富度．

表1 细菌OTU丰度和α多样性

表2 真菌OTU丰度和α多样性

2.2 细菌类群组成及丰度

从表3可以看出，在门水平方面，变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)是2个处理共有的优势门，丰度均大于10%．然而限根栽培后，变形菌门丰度降低2.65%，绿弯菌门丰度降低0.50%，但酸杆菌门丰度增加3.65%，放线菌门丰度降低2.62%，拟杆菌门丰度增加0.17%．

表3 门水平的细菌相对丰度

在属水平方面(表4)，尚未分类的类群(Unclassified)、黄杆菌属(Flavobacterium)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)、类诺卡氏属(Nocardioides)、Gaiella属、硝化螺菌属(Nitrospira)是2个处理共有的优势类群，丰度均大于1%．限根栽培后，尚未分类类群丰度增加5.66%，黄杆菌属丰度增加1.73%，玫瑰弯菌属丰度降低0.12%，类诺卡氏属丰度降低0.71%，Gaiella属丰度降低0.24%，硝化螺菌属丰度增加0.07%．

表4 属水平的细菌相对丰度

2.3 真菌类群组成及丰度

在门水平方面(表5)，子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、尚未分类的类群(Unclassified)、接合菌门(Zygomycota)是2个处理共有的优势类群，丰度均大于5%．限根栽培后，子囊菌门(Ascomycota)丰度增加3.81%，担子菌门(Basidiomycota)丰度降低4.22%，尚未分类的类群(Unclassified)丰度下降0.35%，接合菌门(Zygomycota)丰度增加1.93%．

表5 门水平的真菌相对丰度

在属水平方面(表6)，尚未分类的类群(Unclassified)、Boeremia属、赤霉菌属(Gibberella)、被孢霉属(Mortierella)、毛壳菌属(Chaetomium)、镰刀菌属(Fusarium)、隐球菌属(Cryptococcus)在两种栽培方式中的丰度均大于1%，是2个处理共同的优势类群．限根栽培后，尚未分类的类群丰度降低4.83%，Boeremia属丰度增加15.29%，赤霉菌属丰度降低4.19%，被孢霉属丰度增加1.95%，毛壳菌属丰度增加5.60%，镰刀菌属丰度降低0.43%，隐球菌属丰度增加3.37%．

表6 属水平的真菌相对丰度

3 结论与讨论

采用高通量测序手段，比较万寿菊限根栽培和非限根栽培方式下根际微生物群落组成，发现限根栽培提高了真菌OTU分布的均匀度和丰富度，降低了细菌类群OTU的丰富度，但对细菌的均匀度无影响．限根栽培后，土壤细菌群落的丰富度和多样性指数高于真菌，这与李岩等[13]的研究成果一致，并与土壤中微生物以细菌为主有关[14]．两个处理根际土壤中共有的优势细菌类群与袁鑫等[15]的研究结果一致，该5个细菌门在根际微生物中占有重要地位．限根栽培降低了细菌类群OTU丰富度，这可能是由于限根栽培后，土壤氮含量升高，土壤酸化，从而使得根际土壤细菌群落丰度下降[16]．限根栽培后，酸杆菌门、拟杆菌门的相对丰度增加，而变形菌门、绿弯菌门的相对丰度降低，这与乔清华等[17]的研究结果一致．限根栽培后担子菌门真菌比例减少，子囊菌门真菌比例增加，这可能是由于限根栽培后根系分泌物大量富集造成了土壤中有机酸含量升高，从而导致土壤pH下降，使得真菌群落的丰度下降[18]．在细菌和真菌的各分类水平方面，都检测到丰度不等的尚未分类的微生物类群(Unclassified)，推测是根际土壤中的新微生物种类，这部分序列在数据库中找不到相应的分类信息，可能是受到测序技术的限制．目前，对该类微生物研究较少，且还未对其进行分类．限根栽培后，芽单胞菌的丰度增加了1.24%，芽单胞菌是典型的植物促生菌，通过与植物互作，进行生物固氮，诱导植物激素分泌，促进植物生长[19]．扈进冬等[20]的研究结果表明，链格孢属、赤霉菌属、镰刀菌属中的某些种常常会引起作物真菌性病害．而本研究表明，限根栽培后，赤霉菌属和镰刀菌属的丰度均降低，推测限根栽培降低了病原真菌在根际土壤中的丰度，减少了病原真菌积累．子囊菌门和担子菌门是限根栽培后根际土壤中丰度最高的两个门，也是土壤中最丰富的真菌类群．李发虎等[21]发现这两类真菌能促进根系生长．本研究发现的其他菌群是否与植物健康有关尚不清楚，还需进一步通过试验来验证．根际土壤微生物群落复杂，其群落特征是微生物种群协同作用的结果，根际土壤微生物对植物的影响不能根据单个或几个种群的变化来解释，在后续研究中还需要进行长期的试验和多方面的观察，并结合其他研究者的研究才能进一步揭示其对植物生长的影响．