黄丽佳，梁梦洁，吴双凤，罗 娜，季云瑞，王 雪，郭亚东，邓 亮*

(1．昆明医科大学 药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2．昆明医科大学 计划财务处，云南 昆明 650500)

烟草(NicotianatabacumL.)为双子叶植物(Dicotyledoneac)，属管花目(Tubiflorae)茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiaria)，原产于美洲、澳大利亚和南太平洋岛屿，目前在我国各省均有广泛种植．烟草中含有多种多酚类物质[1]，而该物质是影响烟草生长发育、烟叶色泽、烟气香味及其生理强度等方面的重要物质．此外，多酚类物质是烟草重要的香气前体物，与烟叶香气量和香气类型密切相关[2-4]，因此多酚类物质是决定烟叶品质的重要因素之一．有研究[5-7]报道了烤烟中多酚类化合物含量的测定，所用测定方法主要是采用高效液相色谱法．基于上述分析，本文采用高效液相色谱法同时测定了新鲜烟叶中10种多酚的含量．

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

对照品莨菪苷、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、新绿原酸、芸香苷、莨菪亭、香豆素、山奈酚苷(纯度>98%)(均购于加拿大Toronto Research Chemicals公司)；甲酸(色谱纯，北京百灵威科技有限公司)，乙腈、甲醇(色谱纯, 德国Merck公司)；实验用水为超纯水．

1.1.2 样品

采自云南省石林县耀奇香草谷的红花大金元新鲜烟叶．

1.1.3 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(配置有二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和色谱工作站，美国Agilent公司)；AE240电子天平(精度为 0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)．

1.1.4 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK CR(4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：340 nm；流动相流速：0.8 mL/min；流动相A[V(乙酸)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶10∶88]，流动相B[V(乙酸)∶V(水)∶V(甲醇)=2∶10∶88]；梯度洗脱程序见表1．

表1 流动相梯度洗脱条件

1.2 对照品溶液的制备

分别精密称取莨菪苷、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、新绿原酸、芸香苷、莨菪亭、香豆素、山奈酚苷等10种多酚对照品各 10.0 mg，置于 10 mL 棕色容量瓶中，用分析纯甲醇溶解并定容至刻度，从而得到质量浓度为 1 mg/mL 的多酚标准储备液．

1.3 样品溶液的制备

精密称取新鲜烟叶冻干粉末50.0 mg,置于 15 mL 的离心管中，然后加入80%甲醇溶液5 mL，盖塞密封，超声提取45 min，在常温下，以 10 000 r/min 离心10 min，通过0.45 μm有机相微孔滤膜过滤，备用．

2 结果与分析

将多酚对照品和样品溶液进样后在1.1.4色谱条件下分析，其HPLC色谱图见图1和图2，10个多酚分离良好，峰形对称．

2.1 线性关系考察

通过对标准储备液逐级稀释，配制一系列标准工作溶液，并采用选定色谱条件对10种多酚的系列标准溶液进行测定，以对应各组分的质量浓度C为横坐标(X)，各组分峰面积A为纵坐标(Y)，绘制工作曲线，得回归方程及相关系数．检出限和定量限分别取最低质量浓度标准溶液连续10次进样，计算当信噪比S/N=3和S/N=10时所对应的检测限和定量限，结果见表2．

表2 10种多酚的回归方程、回归系数、检出限和定量限

由表2可以看出，10种多酚在1～50 μg/mL范围内具有较好的线性关系(r>0.999)，其检出限在0.02～0.11 μg/mL之间，定量限在0.07～0.38 μg/mL之间．

2.2 精密度实验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱峰面积，得到新绿原酸、莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、莨菪亭、阿魏酸、香豆素、芸香苷、山奈酚苷10种多酚的RSD值分别为0.9%，0.4%，0.5%，0.7%，1.2%，0.7%，0.6%，1.3%，1.1%，0.7%，表明仪器测定的精密度良好．

2.3 重复性实验

取同一批次样品6个，按1.3项下方法制备后，再按1.1.4项下色谱条件分别进样，测定新绿原酸、莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、莨菪亭、阿魏酸、香豆素、芸香苷、山奈酚苷对应的峰面积，计算其平均质量分数，得到其RSD值分别为1.3%，0.6%，1.7%，2.1%，1.3%，1.2%，1.9%，1.2%，1.5%，1.4%，表明该实验方法重复性良好．

2.4 加标回收率

在已经测定10种多酚含量的新鲜烟叶样品中，分别按高、中、低 3 个质量浓度水平添加一定量的多酚混合标准溶液，连续进样6次，测定多酚的回收率.由表3可以看出，多酚在新鲜烟叶中的平均加标回收率为：90.0%～101.4%，RSD为2.0%～4.8%．

表3 10种多酚的加标回收率和RSD (n=6)

2.5 样品含量测定

取新鲜烟叶冻干粉，按1.3项下进行样品前处理，在1.1.4色谱条件下进样分析，按回归方程计算样品中多酚的含量，得到其平均含量从高到低的顺序为：绿原酸 7 106 μg/g，云香苷 5 441 μg/g，隐绿原酸 5 237 μg/g，山奈酚苷 1 159 μg/g，新绿原酸975 μg/g，咖啡酸723 μg/g，香豆素 256 μg/g，莨菪苷89 μg/g，莨菪亭38 μg/g，阿魏酸28 μg/g．

3 讨论

多酚是烟叶中的重要物质之一，本文建立的方法可以同时测定新鲜烟叶中10种多酚的含量，所用方法的精密度、重复性都较好，在设定的范围内，线性关系良好．回收率测定结果显示，可以满足实验需要．