丁兆润，韩日畴，张 祎*

(1, 华南农业大学农学院，广州 510640；2, 广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260)

蜜蜂属于膜翅目Hymenoptera蜂科Apidae，分布于世界各地，不仅生产蜂蜜、蜂胶、蜂王浆以及其它蜂产品，更是重要的授粉昆虫，对全球农业经济发展起到举足轻重的作用。然而，越冬蜂群的消失(Overwintering Colony Loss，OCL)和蜂群崩溃综合症(Colony Collapse Disorder, CCD)现象的出现(Dennisetal., 2007)，引起了人们对蜜蜂的健康和生存的重视。蜂群的消失与栖息地、农药、害虫和病毒等多方面因素有关，蜜蜂的减少不仅会影响作物授粉,对粮食安全产生威胁，还会对植物多样性及生态平衡带来不利影响(Pottsetal., 2010)。

蜜蜂残翅病病毒(Deformed Wing Virus, DWV)是西方蜜蜂Apismellifera中最常见的病毒。其危害蜜蜂的典型特征是成年蜜蜂翅膀畸形、腹部缩短肿胀、行动乏力和幼蜂迅速死亡(de Miranda and Genersch, 2010)。在没有狄斯瓦螨Varroadestructor的情况下，蜂群中DWV病毒水平低，呈无症状感染。在狄斯瓦螨寄生的蜂群中，DWV滴度明显上升，呈显性症状感染，群势削弱，甚至死亡消失(Kovac and Crailsheim, 1988;de Miranda and Genersch, 2010)。DWV和狄斯瓦螨的相互作用导致西方蜜蜂大量消失的现象，受到世界蜜蜂学家的广泛关注。DWV是单链RNA病毒，基因组约10 kb, 感染力强，易变异，在狄斯瓦螨的媒介作用下，不断扩大着寄主范围，并且演化出新的变异体，DWV-A、DWV-B和DWV-C (Ongusetal., 2004; Zionietal., 2011; Mordecaietal., 2016a)。本文将从DWV的生物学、流行病学、病理学和防治技术4个方面进行综述。

1 生物学

1.1 病毒结构

根据国际病毒分类委员会(ICTV)分类，DWV属于小核糖核酸病毒目Picornavirales传染性软化病毒科Iflaviridae，传染性软腐病病毒属Iflavirus(Vallesetal., 2017)。如图1所示，DWV是单链正链RNA病毒，其基因组是单顺反子，总长度为10 140 bp(不含PolyA长度时)，仅有一个连续开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。基因组的5′UTR长1 144 bp，3′UTR长338 bp，5′UTR 和3′UTR都参与了基因组的复制和翻译。N端包括核糖体翻译起始位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)和先导蛋白(Leader protein，Lp)以及4个结构蛋白，VP1(44 kDa)、VP2(32 kDa)、VP3(28 kDa)和VP4。C端包括RNA解旋酶(Helicase)、病毒基因组连接蛋白(Viral Protein genome linked，VPg)、3C-蛋白酶(Chymotrypsin-like 3C protease，3C-pro)以及RNA聚合酶(RdRp)，其末端有多聚A尾巴(PolyA)(Lanzietal., 2006; Nakashima and Uchiumi, 2009; Dalmonetal., 2017)。

DWV的5′端与Iflaviridae属的其他病毒相比，具有高度的多样性(Murakamietal., 2014)。5′UTR有一个类似四叶草形状的二级结构IRES，与翻译的启动有关。IRES的存在使得许多小核糖核酸病毒目病毒可以通过阻断帽子依赖(Cap-dependent)的翻译起始，从而抑制宿主细胞蛋白的合成，但不影响病毒蛋白的合成，这有利于病毒应对宿主防御机制(Fernándezetal., 2013)。Lp具有多种功能，包括蛋白酶活性，在氨基酸水平高度可变。有研究发现DWV与其变异体VDV-1差异最大位置是Lp，同源性最低只有73.9%(Dalmonetal., 2017)。VPg不仅有稳定基因组的作用，还参与了复制和翻译等过程(Hébrardetal., 2009)。3′UTR区域高度保守，末端以共价的方式连接PolyA，PolyA的长度由遗传决定。图1显示核苷酸标度及各元件相应核苷酸数量；非结构蛋白在上方，结构蛋白在下方；箭头表示一些关键的重组区域，包括DWV基因组Helicase、5′UTR 和Lp编码的区域。

图1 DWV基因组的示意图Fig.1 Schematic diagram of DWV genome注：根据文献 Lamp et al., 2016和Dalmon et al., 2017修改。

通过冷冻电子显微镜(Cryo-Electron Microscopy)和X射线晶体学发现DWV是轻微的椭球体结构，其直径约30 nm，病毒衣壳为对称的伪T3二十面体，不含脂膜(kubníketal., 2017)。结构蛋白VP1、VP2和VP3的亚基排列成原聚体，在衣壳蛋白上每5个原聚体形成一个单位，五聚体的封闭和开放控制着病毒的释放过程(Organtinietal., 2017)，衣壳蛋白在保护病毒RNA不被RNA酶降解和确定病毒宿主的特异性等方面也起着重要作用。当环境pH改变或者在高浓度的非生理性离子条件下，DWV的衣壳三维结构会发生变化，特别是衣壳蛋白VP3的C末端延伸在病毒表面形成的p-结构域，表现为突出球状延伸；病毒衣壳构象的变化，可能会产生新的催化位点，从而影响病毒进入宿主细胞(Organtinietal., 2017;kubníketal., 2017)。Picornavirales的大多数病毒基因组编码的小蛋白VP4已经被证明参与了细胞膜通透性的改变，例如吸血猎椿病毒(Triatoma Virus，TrV)的VP4小蛋白插入膜中，形成新的蛋白通道，而当pH值越高时，膜的渗透性也越高(Sánchez-Eugeniaetal., 2015)，DWV中的VP4小蛋白也可能影响着膜的透性。

1.2 病毒变异及进化关系

RNA病毒具有很高的突变率，变异后的毒株共同存在并感染寄主的现象是病毒感染的特征之一，影响着病毒的复制、传播和疾病诱导等过程。目前发现DWV主要有3种基因型：DWV-A、DWV-B和DWV-C (Lanzietal., 2006; Zionietal., 2011; Mordecaietal., 2016a)。

图2-a显示了基于RdRp的氨基酸序列保守区域的贝叶斯系统进化推理，节点上显示贝叶斯支持值。根据系统发育学分析，DWV各基因型的亲缘性不同，DWV-A与DWV-B亲缘性较近，属于同一分支，DWV-C虽然与DWV-A和DWV-B不属于同一分支，但相比于囊状幼虫病毒(Sacbrood Bee Virus，SBV)，与DWV-A和DWV-B的亲缘性更近。

DWV最初基因，现在称为DWV-A基因型，包括先前大部分DWV序列和Kakugo病毒(KV)(Lanzietal., 2006)。通常，在无狄斯瓦螨的蜂群中，DWV表现为低水平，无症状感染，然而狄斯瓦螨存在时，会导致DWV的载量显著增加，流行率上升，呈现明显症状(Ryabovetal., 2014)。早先研究发现，诱导显性感染的狄斯瓦螨体内的DWV水平，远高于诱导隐形感染的狄斯瓦螨的DWV水平，暗示着DWV在狄斯瓦螨体内复制到一定阈值，才能表现出致病症状(Gisderetal., 2009)。而其他的研究则发现狄斯瓦螨体内的DWV水平呈高度动态，主要由狄斯瓦螨取食过程决定，而不是依赖狄斯瓦螨体内的复制。取食低DWV-A水平蜂蛹的狄斯瓦螨传代后，子代螨传播DWV-A的能力下降，说明DWV-A进化更倾向于寄生蜜蜂，而不是寄生狄斯瓦螨(Posada-Florezetal., 2019)。

DWV-B包括狄斯瓦螨病毒(VDV-1)以及VDV-1-DWV重组体。VDV-1是从狄斯瓦螨组织中分离到的类病毒，与DWV具有84%的核苷酸同源性，差异主要集中在5′UTR区域。VDV-1能和DWV共同感染蜜蜂，并与DWV-A发生基因重组，产生重组体VDV-1-DWV，VDV-1-DWV是强毒株型，导致蜜蜂残翅(Ongusetal., 2004; Zionietal., 2011)。

蜂群中一种基因型的流行导致了另一种基因型不占优势，这种现象叫“重复感染排除”，新产生的变异体一定程度上保护了蜂群(Mordecaietal., 2016b)。例如，DWV-B的出现与狄斯瓦螨的流行关系密切，并且因为狄斯瓦螨的存在导致了病毒遗传多样性的快速下降 (Martinetal., 2012)。然而关于DWV多样性变化以及变异体之间相互排斥、相互竞争的观点还存在争议。病毒与宿主之间始终是在相互适应，不断进化的过程中。有研究发现，即使在有狄斯瓦螨的蜂群中，依然存在DWV的高度多样性。通过反向遗传学实验发现，不同变异体的复制频率相似，而且广泛存在重组现象，但缺乏协同效应和排斥竞争效应，这种病毒高度共存的现象，是DWV不断适应宿主的结果，有利于病毒形成抗RNA干扰能力，来应对宿主的防御机制(Ryabovetal., 2019)。

DWV-C与前面描述的DWV-A和DWV-B不同，是一个新的、独立的分支。从英格兰南部德文郡地区的蜂群中，采集经历越冬群落损失后存活的无症状蜜蜂样本，进行双末端测序，发现新的DWV变异体，命名为DWV-C (Mordecaietal., 2016a)。

图2-b显示了DWV变异体的同源百分比单位矩图：氨基酸(下划横线)；核苷酸(无下划横线)。DWV-C与DWV-A和DWV-B在核苷酸序列和氨基酸序列都存在差异，并且存在A型与C型重组或者B型与C型重组现象。在蜜蜂蜂群中，狄斯瓦螨传播的DWV变异体主要是B型，而与C型无关。而对欧洲越冬消失的蜂群样本进行DWV三种变异体检测发现，DWV-C是越冬蜂群消失最后一个月的优势基因型，暗示着DWV-C影响着越冬蜂群消失(Kevilletal., 2017)。更多地区的样本调查显示，DWV-C在流行性和病毒载量方面，与DWV-A和DWV-B相比，呈较低水平(Kevilletal., 2019)。然而，在调查巴西的无刺蜂Meliponasubnitida蜂群时发现，蜂群广泛存在DWV-C，且表现为显性变异，这表明不同的寄主生物对不同DWV变异体的敏感性可能不同，这也影响着DWV变异体在不同寄主间的流行情况(de Souzaetal., 2019)。

图2 三种基因型的进化关系及同源性Fig.2 Phylogeny and homology analysis of three genotypes注：根据文献Mordecai et al., 2016a和 Martin and Brettell, 2019修改。

1.3 DWV的研究方法

1.3.1DWV病毒粒子形态观察

DWV是RNA病毒，有变异、重组以及隐形感染现象，诊断存在困难。与其他病原体相比，DWV的颗粒极其微小，普通的光学显微镜无法观察，通过透射电镜，才能观察到纯化后病毒颗粒的形态特征，然而这只能较为精确地测定DWV的大小、形状及相对位置，结合X射线晶体学才能够进一步分析DWV的三维结构(kubníketal., 2017)，但还无法精确区分病毒的种类。

病毒粒子的形态观察建立在病毒粒子的分离纯化基础上，氯化铯浓度梯度超速离心法是分离纯化蜜蜂病毒的常用技术，具体步骤如下(Fannon and Ryabov, 2016)：

1)收集5 g蜜蜂(一般采集症状明显、发育不良的残翅成年蜜蜂比较容易分离到病毒粒子)，在研钵中加入35 mL PBS缓冲液(100 mM PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4)，研磨均匀。

2)4℃，10 000 rpm离心12 min。去除上层脂质层和底部未完全研磨组织颗粒层，保留中间层。

3)准备一个30 mL离心管，里面加入 2.5 mL 20%蔗糖溶液(蔗糖用PBS缓冲液配制)，随后加入上述中间层溶液，不要混匀，置于上层，这样超速离心过程中上层中的病毒粒子可以穿过0.5 cm的蔗糖层到达底部。

4)18℃，28 000 rpm离心3 h 30 min(SW28 Beckman 角转头)。弃上层，收集底部沉淀，重悬于2 mL PBS缓冲液，4℃过夜，以便充分重悬病毒粒子。

5)制备氯化铯梯度溶液。35 mL超速离心机专用离心管，从底部往上依次加入5 mL密度为1.6 g/cm3、1.5 g/cm3、1.4 g/cm3、1.3 g/cm3和1.2 g/cm3。不同密度的氯化铯溶液都是加PBS缓冲液稀释饱和氯化铯溶液而得。最后将上一步所得的病毒粒子溶液加在最上层。

6)4℃，28 000 rpm离心18 h(SW28 Beckman水平转头)。

7)收集每个间隔层的1.5 mL溶液，主要可能存在于1.3～1.4 g/cm3的间隔层，混合所有收集到的溶液，用PBS缓冲液稀释5～10倍。

8)4℃，28 000 rpm离心3 h(SW28 Beckman 角转头)，收集底部沉淀，重悬于200 μL 0.1M，pH 7.4的PBS缓冲液。-80℃保存备用。

1.3.2DWV的分子鉴定

通过电镜观察到病毒颗粒的形态特征后，还需要分子生物学技术来明确病毒的种类。免疫学检测是利用针对病毒衣壳蛋白高度特异性抗体作为探针，来定性和定量检测病毒。目前，多采用酶联免疫技术来检测DWV，然而这种方法只适用于检测高浓度的DWV，当不同病毒的基因同源性较高时，免疫学检测的特异性较差。利用分子技术检测不同病毒核苷酸序列的差异，可以准确地鉴定出病毒的种类。

在蜜蜂残翅病的诊断中，反转录聚合酶链式反应技术(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)应用最广泛。RT-PCR将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合，是一种针对目的产物RNA的核酸分子检测技术。其原理是RNA单链在逆转录酶的作用下合成互补DNA(cDNA)，随后以cDNA为模板，在引物和DNA聚合酶的作用下，不断进行目的基因的循环扩增，因此可以检测较低水平的DWV样本，具有很高的灵敏性(Lanzietal., 2006)。

随着分子技术的发展，新的PCR技术也不断应用于蜜蜂病毒病的诊断，如定量PCR(Quantitative PCR)能对DWV等RNA病毒浓度进行定量检测，来研究病毒载量与危害症状的关系(Highfieldetal., 2009)；多重PCR(Multiplex PCR)可以同时检测多重病毒(Sguazzaetal., 2013)，提高检测的效率；巢氏PCR(Nested PCR)通过两轮PCR来提高反应的特异性(Fannon and Ryabov, 2016)。目前，基于PCR的核酸分子检测技术相比于传统免疫学检测技术，具有高效、精确和低成本等优势，已广泛应用到蜜蜂病毒学的研究工作中。高通量测序是目前用于发现新病毒的主要技术，DWV的几种变异体都是通过高通量测序而发现的(Mooreetal., 2011)。

1.3.3DWV的体内复制示踪

为研究DWV的致病机制，需要研究病毒在体内的分布复、制繁殖以及对组织细胞的危害。链特异性逆转录(Strand specific RT-qPCR)是用于特异性检测病毒的反义链，结合TaqMan定量PCR技术则可以方便的检测到DWV是否在宿主体内复制及其繁殖量(Boncristianietal., 2009)，但是无法直观观察病毒在宿主的具体组织和具体位置的复制繁殖。利用原位杂交技术(In-situ hybridization)可检测DWV在蜜蜂大脑内的复制，分别使用正链和反义链探针，检测DWV的反义链基因组和正链基因组，结果显示在视觉神经网、蘑菇体和触角神经叶都检测到DWV正链信号，同时也都有稍弱的反义链信号，说明DWV在蜜蜂大脑内成功复制繁殖(Shahetal., 2009)。而免疫组化技术也应用到检测DWV是否在狄斯瓦螨体内繁殖，结果没有在狄斯瓦螨的组织内检测到DWV特异性反应指示信号，只在中肠腔内的粪便上检测到(Teresaetal., 2008)。以上技术都非常确定可以检测DWV反义链，说明DWV确实发生了复制和繁殖，但是都杀死了目标昆虫，是在非活体组织上研究。如何能够在活体观察DWV的繁殖呢？2019年，通过构建重组DWV基因组并在起始位置加上eGFP标记蛋白，可以非常直观的在荧光显微镜下观察DWV的去向以及复制增殖(Ryabovetal., 2020)。这项技术是美国农业部蜜蜂研究所(USDA-ARS，Bee Research Lab)的最新研究结果。

1.3.4DWV基因组体外重组

由于缺乏细胞培养体系、血清学试剂、特定病毒株或克隆株，尽管经过了几十年的深入研究，到目前为止，所有的研究都使用了直接从蜂箱采集的受感染的蜜蜂模型和病毒分离物。

多个病毒株、主变异体甚至种可能同时出现在这些分离物中，因此可能会得到一些错误的结论。构建体外重组病毒(反向遗传学)则可以绕过病毒分离和纯化，在细胞克隆培养系统中生产克隆病毒。有实验选择DWV-A 1414株作为目标病毒株，根据Genebank中4个DWV-A的基因组序列(AJ489744、AY292384、JQ413340、AB070959)设计了28条引物。首先使用巢式RT-PCR分段获得基因产物并测序验证序列，然后分别获得5′端和3′端两个有重叠区域的大片段，最后设计一对可扩增全基因组的引物，使用One-Step RT-PCR扩增获得全长。随后将纯化的10 164 bp DWV-A的全长序列插入到pBR322载体，转化大肠杆菌HB101菌株。在构建过程中，还在适当的位置插入了酶切位点，从而提取质粒后可以通过酶切获得线性化病毒用于后续研究(Lampetal., 2016)。应用该方法还能构建了多个DWV克隆珠系，研究这些混合株系在同一个蜜蜂中的复制动态(Ryabovetal., 2020)。该技术的应用与发展为病毒的感染与致病机理研究奠定基础。

2 流行学

2.1 DWV的发现历史及寄主范围

1977年，人们在无症状的埃及蜜蜂身上首次分离出DWV，但误认为DWV是埃及蜜蜂病毒(Egypt Bee Virus，EBV)(Baileyetal., 1979)。1982年在日本畸形成年蜜蜂身上也分离出DWV，通过在血清学分析发现DWV与EBV虽存在亲缘性，但亲缘关系较远。由于这种分离出的病毒使成年蜜蜂表现出翅膀残缺症状，因此被命名为残翅病病毒(DWV)(Bailey and Ball, 1991)。DWV最初被发现危害英国、拉丁美洲和南非等国家和地区的蜜蜂种群(Allen and Ball, 1996)，但随着狄斯瓦螨的传播，DWV的流行范围不断扩大(Ryabovetal., 2014)，成为目前最流行的蜜蜂病毒，对32个国家的调查显示，蜂群中DWV的平均感染率至少为55% (Martin and Brettell, 2019)。尽管DWV的毒力相对较低，但在狄斯瓦螨侵染过的蜜蜂中，DWV是持续增殖的，一旦感染就可能爆发，导致成蜂残翅以及蜂群损失(Schroeder and Martin, 2012; Mondetetal., 2014)。

目前，DWV的宿主涵盖了10个目的68种节肢动物，其中64种节肢动物属于昆虫纲Insecta，包括膜翅目Hymenoptera、半翅目Hemiptera、鞘翅目Coleoptera、双翅目Diptera、鳞翅目Lepidotera、革翅目Dermaptera和蜚蠊目Blattodea 7个目。4种节肢动物属于蛛形纲Arachnida，包括蜱螨目Arachnoidea、蜘蛛目Araneae和盲蛛目Opiliones 3个目(Martin and Brettell, 2019)。

2.2 DWV的传播特征

DWV作为一种专性寄生性生物，其生存依赖于活体宿主细胞的生命机制。为了不断繁殖，DWV需要从一个寄主传播到另一个寄主。DWV的传播包括了水平传播与垂直传播。传播方式决定着DWV的存在水平以及增殖速度，进而影响着DWV的毒力大小以及流行情况，最终表现在对寄主危害程度和宿主范围大小的变化。

2.2.1水平传播

2.2.1.1 食物源-消化道传播

食物源-消化道传播是指DWV寄主在食用受污染的食物或者通过消化道排出有病毒的粪便后，发生病毒传播和感染的现象。不管是蜜蜂的食物来源如蜂蜜、蜂王浆、花粉等，还是蜜蜂体内的胸腺、下咽腺、中肠等部位，以及蜜蜂排出的粪便，均检测到DWV阳性，暗示着在蜜蜂取食、喂食、护理幼虫或者清理巢房时，会发生DWV的水平传播(Yue and Genersch, 2005；Singhetal., 2010)。

花粉是蜜蜂生长发育的主要蛋白质来源，对蜜蜂的营养代谢有着重要影响。通常情况下，未被蜜蜂采集的花粉不存在DWV，而蜜蜂采集后的花粉检测到DWV存在，说明DWV的水平传播可以通过传粉昆虫的访花过程发生(Mazzeietal., 2014)。花粉中蛋白质与脂类的比例不同，也影响着传粉昆虫的觅食偏好性((Vaudoetal., 2016)，从而影响了DWV的水平传播速率。

蚂蚁是DWV的寄主之一，与DWV的食物源传播也有着密切关系。野外的蚂蚁Myrmicarubra经常取食死亡的蜜蜂，而死亡的蜜蜂体内很有可能携带DWV (Schläppietal., 2019)，暗示着食物源传播是DWV跨物种水平传播的机制之一。

2.2.1.2 媒介传播

DWV的最初寄主是西方蜜蜂，在蜂群中致病力较弱，存在水平较低，呈隐性感染存在。而狄斯瓦螨最初寄主是东方蜜蜂Apiscerana，因其传播到西方蜜蜂蜂群，才改变了DWV流行程度及其多样性，成为DWV最主要的传播媒介(Möckeletal., 2011; Wilfertetal., 2016)。一方面，狄斯瓦螨本身的寄生行为，影响着蜜蜂的健康及生理状态(张祎和韩日畴, 2012)；另外一方面，狄斯瓦螨的取食行为，使DWV跨越体壁或围食膜等生理障碍，直接传播到蜜蜂的血淋巴，导致蜜蜂的DWV水平上升。虽然DWV能否在狄斯瓦螨体内复制尚存在争议，但因狄斯瓦螨寄生和取食的特性，直接导致了蜂群中DWV的快速流行以及多样性的下降，并且通过蛋白组学，也证明狄斯瓦螨体内并没有进行DWV的复制，所以DWV的多样性主要取决于传播途径而不是是否在狄斯瓦螨体内增殖(Ryabovetal., 2014; Erbanetal., 2015)。DWV还以狄斯瓦螨为媒介，实现跨物种水平传播，如Bombuspascuorum和Bombusterrestris等大黄蜂的蜂群已存在DWV的流行，并且发生着DWV的不同变异体的流行性以及毒力的改变(Manleyetal., 2019)。

此外，梅氏热厉螨Tropilaelapsmercedesae是蜜蜂的另外一种寄生螨，也是携带和传播DWV的媒介，梅氏热厉螨可能成为DWV流行的新载体(Khongphinitbunjongetal., 2016)。

2.2.1.3 体表传播

蜜蜂是一种会飞行的群居性昆虫，蜂巢内庞大的蜜蜂数量和个体间频繁的身体接触极易导致蜜蜂病毒的传播。冬季是蜜蜂休憩的季节，然而由于冬季环境温度较低，蜜蜂不得不聚集在一起以保存和提高热量，保持代谢率。蜜蜂身体接触的过程中，很容易出现表皮破损，如体表绒毛掉落，这有利于病毒从伤口进入蜜蜂体内，进而导致病毒在蜂群中的流行，这也是冬季蜂群消失的原因之一。而蜂群密度过大时或者在外界蜜源缺乏出现盗蜂时，同样会增加蜜蜂个体的身体接触，导致DWV的快速流行，因此，适当的分蜂处理，有利于抑制蜜蜂病毒在蜂群中传播(Bailey and Ball, 1991)。

2.2.2 垂直传播

垂直传播是由亲代传播到子代的一种传播方式。研究发现，尽管蜂王与雄蜂都表现为健康状态，但在蜂王卵巢和雄蜂精囊却检测到了DWV，暗示DWV垂直传播的可能。实验室利用人工授精的方式，用DWV阳性精子与蜂王DWV阴性的卵子结合，或者DWV阴性精子与蜂王DWV阳性的卵子结合，均产生了DWV阳性的受精卵，发育为感染DWV的工蜂。DWV阳性未受精的卵也可直接发育为感染DWV的雄蜂，即DWV可以通过父系或母系，垂直传播给后代(Yueetal., 2007; de Miranda and Fries, 2008)。

通过自然交配的方式，受感染的雄蜂能与正常的雄蜂竞争，并与蜂王交配，使蜂王携带DWV。蜂王交配后的DWV载量明显高于未交配的对照组，并且DWV主要存在于腹部和胸腔，而头部、卵巢、精囊和精子的病毒载量较低，暗示DWV存在垂直传播的途径，但主要依赖水平传播 (Amirietal., 2016)。

DWV的垂直传播可进一步分为病毒在卵表面传播的经卵传播和病毒在卵内传播的经卵传播。研究发现，发现卵感染DWV的水平与蜂王巢房感染DWV的水平存在正相关关系，而当蜂王感染DWV水平较低时，则通常无法检测到卵含有DWV。对卵表面进行漂白剂处理以及无菌水清洗后，发现DWV的浓度相对于未处理的空白对照显著下降，表明DWV的垂直传播更多依赖于卵表面传播，而不是卵内传播(Amirietal., 2018)。

寄主在感染DWV后，体内转录反应会发生变化，如免疫系统基因的表达或抑制，进而适应DWV不同的传播方式。通过对相关基因的定量检测，或许更有利于理解DWV的水平传播与垂直传播以及这些途径对宿主带来的影响(Ryabovetal., 2016)。

3 病理学

3.1 DWV对蜜蜂的危害

DWV是引起蜜蜂感染后具有明确疾病症状的几种蜜蜂病毒之一。DWV感染的典型症状包括成年蜜蜂翅膀皱缩、体型缩小和变色，蛹发育缓慢和幼蜂迅速死亡等(Kovac and Crailsheim, 1988;de Miranda and Genersch, 2010)。DWV感染蜜蜂后，在蜜蜂大脑负责视觉和嗅觉等关键区域复制，最终导致蜜蜂行为异常(Shahetal., 2009)。DWV不仅感染蜜蜂的大脑，还感染分泌腺和脂肪体(Fujiyuki etal., 2009)，而脂肪体对昆虫的新陈代谢、免疫和信息素的产生起着重要的作用。

比较分析DWV感染的症状蜜蜂与无症状蜜蜂，发现有症状的蜜蜂触角中含有大量的DWV，病毒衣壳在蜜蜂触角上皮区域聚集，呈晶体状排布，而且感染的区域完整性也受到破坏，暗示着触角的功能受损，进而影响蜜蜂的交流(Kimetal., 2019)。DWV还损伤蜜蜂神经元，促使工蜂过早成熟，过早地从内勤蜂转变为采集蜂(Tranielloetal., 2020)。DWV的复制水平影响着蜜蜂的寿命，与蜜蜂越冬群体的损失有着很强相关性，有实验表明，冬季蜜蜂DWV载量增加，与参与细胞免疫的基因表达减少有关，导致了蜜蜂对DWV的易感性，最终危及越冬蜜蜂群体(Steinmannetal., 2015)。DWV对蜂蛹表现出低毒性，感染了高水平DWV的蜂蛹，仍然能正常发育，死亡率较低(Remnantetal., 2019; Teheletal., 2019)。

3.2 DWV的致病机理

3.2.1DWV与媒介的协同作用

生物因素和非生物因素的胁迫增加着蜜蜂感染病毒的风险，除了温度变化和蜜蜂自身群体的强弱影响着蜜蜂对病毒的抵抗力外，狄斯瓦螨的媒介作用直接改变了蜂群中DWV的传播情况 (Priscoetal., 2011)。有研究从动态学的角度，建立模型来阐述蜜蜂-DWV-狄斯瓦螨三者的相互关系 (Kangetal., 2016)，而狄斯瓦螨与DWV的协同关系包括影响着病毒症状的显隐性、DWV的复制水平和流行率以及蜜蜂的免疫反应等方面。

病原寄生于寄主，有两种表现方式：隐性感染和有症状的显性感染。表现为哪种感染，与病原的载量、毒力、传播途径以及寄主的免疫反应等多方面因素有关(Sorrelletal., 2009; Rigaudetal., 2010)。在没有狄斯瓦螨的情况下，DWV在蜂群中通常呈低水平，表现为隐性感染(Shutleretal., 2014; Robertsetal., 2017)。相反，在存在狄斯瓦螨的蜂群中，DWV在蜂群中通常呈高水平，感染DWV的成蜂出现翅膀残缺、寿命缩短等症状，以及冬季蜜蜂种群损失现象，表现为显性感染(Dainatetal., 2012; Wuetal., 2017)。

DWV可以感染西方蜜蜂的雄蜂及各个龄期的工蜂，DWV的滴度从低到高依次是正常成年雄蜂、正常成年工蜂、幼虫、残翅成年蜂、蛹(Chenetal., 2005)。而狄斯瓦螨的存在不仅导致蜜蜂体内DWV滴度的不断增加、蜜蜂种群中DWV的流行率陡增，还导致DWV多样性的大量减少，最终形成DWV单一优势和高致病性(Martinetal., 2012)。狄斯瓦螨的唾液中存在毒性蛋白(Varroatoxic protein，VTP)，在缺乏DWV的情况下能直接杀死东方蜜蜂的幼虫和蛹，其重组表达的VTP能引起DWV滴度的升高和成蜂翅膀的不正常发育(Zhang and Han, 2018)。

关于DWV与狄斯瓦螨的协同作用对免疫系统的影响，目前还存在争议。有研究认为感染DWV后的蜂蛹，因狄斯瓦螨的诱导而产生免疫抑制，有利于DWV进一步复制(Yang and Cox-Foster, 2005)。其他实验也发现狄斯瓦螨通过干扰NF-kb信号途径，抑制了体液免疫和细胞免疫，从而促进了螨的繁殖，这也暗示着狄斯瓦螨与DWV之间存在互利共生的关系(Di Priscoetal., 2016)。然而，相反的观点则认为随着狄斯瓦螨数量的增加，免疫反应可能会被激活(Zhangetal., 2010)。对蜜蜂进行实验性创伤后，检测到蜜蜂DWV滴度上升和相关的免疫基因表达上调，这表明狄斯瓦螨吸食血淋巴并不会抑制蜜蜂的免疫系统；相反，蜜蜂免疫基因表达增加，一定程度上抑制了狄斯瓦螨的繁殖(Kusteretal., 2014)。蜜蜂对DWV与狄斯瓦螨的免疫反应可能不呈持续稳定状态，初始DWV的水平较低，这是由于Toll途径转录因子和其他免疫效应分子的高水平表达，但这种表达是暂时性的，伴随着这些途径的下调，DWV开始不断地复制(Zhaoetal., 2019)。

3.2.2DWV与杀虫剂的协同作用

农药，特别是以神经系统为靶标杀虫剂，如新烟碱类农药，在防治螨类的同时，对蜜蜂这类传粉型昆虫，不仅有着直接致命影响(Samuelsonetal., 2016)，还能与DWV产生协同作用，间接加重对蜜蜂的危害。研究发现死亡的蜜蜂中杀虫剂的含量与DWV等病毒的流行率呈正相关，这意味着杀虫剂可以协同并加重DWV对蜜蜂健康的危害，威胁蜂群的生存(Martinelloetal., 2017)。病毒与杀虫剂在蜜蜂上的协同作用关系比较复杂：杀虫剂可能成为病毒复制的加速因子，导致病毒大量扩增，进而危害蜜蜂(Diaoetal., 2018)，但更高的杀虫剂剂量不意味着一定会引起更高的病毒滴度，而是通过对昆虫免疫信号的负调节作用，来降低蜜蜂对病毒感染的耐受度(Di Priscoetal., 2013; Coulonetal., 2018)。

3.2.3DWV与其他病原体的共同感染

蜂群同时感染多种病原体是非常普遍的现象(Granbergetal., 2013)。当两种病原体同时感染宿主时，可能是互利关系(Positively)也有可能是竞争关系(Negatively)或者互不影响(Independently)。

微孢子虫Nosemaceranae是一种干扰蜜蜂蛋白质代谢的专性寄生虫。最初的研究发现微孢子虫与DWV共同感染存在拮抗作用，这两种病原体在蜜蜂的中肠呈显著的负相关，但在蜜蜂头部或胸部，两者没有表现出相关性(Costaetal.,2011)。之后在蜜蜂中肠的实验，进一步证明微孢子虫与DWV呈不对称的竞争关系，且不利于DWV的繁殖。如果蜜蜂先感染DWV，微孢子虫能够正常繁殖，但如果蜜蜂先感染微孢子虫则抑制DWV的增殖(Doubletetal., 2015)。微孢子虫与DWV的共同感染影响，还与营养物质有关。在没有花粉的条件下，微孢子虫的感染提高了蜜蜂体内的DWV水平，但有花粉的条件下，感染微孢子虫的蜜蜂与没感染微孢子虫的蜜蜂相比，DWV水平没有显著差异，暗示着营养物质能减少病原体寄生的影响，或者提高蜜蜂的免疫力(Zhengetal.,2015)

花卉是蜂类采蜜和传粉的主要植物，也是各种病原体的寄主。蜂类在访花过程中，受到多种病原体的共同感染，使蜂群的数量和丰富度迅速下降(Sachman-Ruizetal., 2015)。DWV在不同的植物物种间分布不均匀，DWV如何通过花传播和扩散，取决于植物的性状、病毒株的传染性、寄主免疫能力以及昆虫觅食行为等(Algeretal., 2019)。

3.2.4DWV与营养物质的关系

DWV复制水平，与蜜蜂吸收的营养物质有着密切关系。花粉含有蛋白质、糖类、脂类、维生素和矿物质等，是蜜蜂重要的营养物质来源。最初有研究发现，花粉与糖水相比，前者能激活健康蜜蜂相关的营养代谢途径，如卵黄蛋白原(Vg)基因的表达，进而能对蜜蜂寿命产生积极影响，但是狄斯瓦螨的寄生行为抑制了蜜蜂的相关代谢途径，即使摄入花粉也不能逆转这种影响，并且花粉的摄入有利于DWV在蜜蜂体内的繁殖(Alauxetal., 2011)。

然而，另外的实验证明，对于正常的蜜蜂，花粉和糖水喂食，两者对蜜蜂寿命影响差异不大，但当蜜蜂被狄斯瓦螨寄生时，花粉能明显提高蜂群存活率，并且喂食花粉的蜜蜂比喂食糖水的蜜蜂，具有更低的DWV水平，并且对微孢子虫的耐受性上升，这可能与花粉中的非极性物质，如脂类有关，反映了花粉可能有助于减少蜂群损失(Annosciaetal., 2017; Tritschleretal., 2017)。

值得注意的是，蜜蜂消化花粉的能力有限，过量取食花粉反而对蜜蜂造成危害。只有摄入的蛋白质被蜜蜂有效地吸收，才能维持蜜蜂血淋巴中的蛋白质正常水平，进而促进蜜蜂的健康以及提高蜜蜂对病原的耐受性(Basualdoetal., 2014;Paolietal.,2014)。蜜蜂的营养代谢与肠道细菌群有着密切关系，在有肠道细菌的存在下，即使不提供花粉，蜜蜂的营养代谢和免疫系统不会受到很大影响，但如果使用抗生素，破坏蜜蜂肠道中的细菌群，蜜蜂的寿命会显著缩短(Lietal., 2019)。营养物质与病原和寄主的相互作用机制，仍需要进一步研究。

4 防治

DWV的流行与爆发会给蜜蜂养殖产业以及背后的农业经济造成巨大损失，但目前还没有针对DWV的特效药物。为了减少DWV的传播与危害，可以从以下两个方面着手：一是切断DWV的传播途径；二是应用RNAi技术来抑制蜂群中DWV的繁殖。

4.1 DWV传播途径的切断

DWV寄生于蜜蜂，水平较低时以隐形感染的的方式，长期广泛地存在于蜂群中，当遇到外界压力的激活或者环境因子的协同作用，往往会快速繁殖，表现显性症状，造成蜜蜂残翅病的爆发和流行。其中，狄斯瓦螨作为DWV的传播媒介，极大地影响了DWV的流行情况。

为了减少DWV的传播机会，一方面，从源头出发，保证洁净的养蜂环境，定期对蜂具用品全面清洁消毒。对来源复杂和规模较大的蜂群采取分散隔离方式放置，减少交叉感染机会(张炫等, 2012)。另一方面，要积极采取防治狄斯瓦螨措施，减少DWV的媒介传播途径。由于雄蜂房的巢房大小、封盖时间以及繁殖环境的优势，雄蜂房的狄斯瓦螨感染率是工蜂房的8～10倍(张祎和韩日畴, 2012)，因此割除雄蜂房可以大大减少狄斯瓦螨的数量(Wantuch and Tarpy, 2009)，但在实际操作中，比较费时费力；杀螨剂可有效防治狄斯瓦螨，针对狄斯瓦螨的不同分子靶点，最主要有神经靶点和肌肉靶点(Sparks and Nauen, 2015)，可使用蝇毒磷、联苯菊酯、拟除虫菊酯、双甲脒、精油、硫丹等杀螨剂，然而大量反复使用杀螨剂，不仅导致了狄斯瓦螨的抗药性不断上升，还会危害蜜蜂健康以及产生蜂产品农药残留问题(Hillieretal., 2013; Sabováetal., 2019)；生防菌包括真菌与细菌对狄斯瓦螨均有一定毒力(Hamiduzzamanetal., 2012; Alquisira-Ramírezetal., 2017)，但还没有广泛应用，表现出明显经济效益；从寄主的角度出发，培育抗螨的蜜蜂品种，这种途径虽然不容易实现但潜力无限。直接通过人工授精的方式，蜜蜂可能无法表现出抑制螨繁殖的性状(Beaurepaireetal., 2019)。通过分子遗传学手段，增强蜜蜂梳毛行为、螨敏感卫生行为等数量性位点基因的表达，可以培育出抗狄斯瓦螨的蜜蜂品种(Zakaretal., 2014)。目前已有抗螨的蜜蜂品种，如俄罗斯蜜蜂品种(Russia Honey Bee，RHB)，成功面向市场(Kirraneetal., 2018)。

4.2 RNAi技术的应用

目前生物技术RNA干扰(RNA interference, RNAi)在防治DWV方面取得新的进展。RNAi指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，主要有3种途径：microRNA(miRNA)途径、piwiRNA(piRNA)途径和small interfering RNA(siRNA)途径。在害虫防治中应用是siRNA途径(Jogaetal., 2016)，其原理是将外源的dsRNA导入到害虫体内，从而激活“siRNA途径”，Dicer酶将dsRNA切割为24～31 nt左右的小分子RNA，引起同源mRNA特异性降解，沉默重要的基因，最终达到防治害虫的目的。

早期研究用注射法传递dsRNA到狄斯瓦螨身上，表现出高达97%的RNAi效率 (Campbelletal., 2010)，然而注射法却不适用于大规模的防治。用含有dsRNA的蔗糖溶液喂养蜜蜂，在蜜蜂血淋巴中检测到dsRNA的存在，狄斯瓦螨取食蜜蜂的血淋巴后，dsRNA从蜜蜂水平转移到狄斯瓦螨，实现狄斯瓦螨的致死率在60%以上，且dsRNA不会对蜜蜂自身造成影响(Garbianetal., 2012)。dsRNA不仅可以转移到蜜蜂不同的组织、不同发育阶段，也可以通过蜂王转移到后代且具有生物学活性(Maorietal., 2019)。

细菌也可作为dsRNA的表达载体，dsRNA经细菌表达，再纯化后喂食蜜蜂，蜜蜂体内病毒的表达水平下降，幼虫存活率上升，用细菌来大规模生产dsRNA，是一种新的抗病毒策略(Zhangetal., 2016)。

RNAi也被广泛应用在揭示细胞色素P450单加氧酶(CYPs)、羧酸酯酶(CarEs)和谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)等基因在杀虫剂解毒和抗性中的作用。螨类经杀螨剂处理后，相关解毒基因的mRNA转录水平升高，死亡率下降，通过RNAi处理，解毒基因表达显著下降，导致螨的敏感性和死亡率显著上升(Liaoetal., 2016; Shenetal., 2016)，RNAi将有利于减低螨的抗药性以及减少用药成本。

RNAi的效率不仅与dsRNA的长度和浓度有关，还与dsRNA的完整性有关(Milleretal., 2012)。通过纳米颗粒或者脂质体将dsRNA包裹起来，再传递到昆虫体内，能明显提高RNAi效率，而这些物质在保护dsRNA完整性的同时，自身容易降解(Heetal., 2013; Taningetal., 2016)。RNAi的效率还取决于多方面因素，包括靶标基因的设计、靶标昆虫的种类、龄期、取食行为以及免疫系统等。随着对RNAi的深入研究，相信未来基于dsRNA的生物农药也将得到应用与推广，但RNAi对于非靶标生物也存在潜在风险，只有做好风险评估与预防，RNAi应用安全性才能得到保证，从而更好地实现目标生物防治。

5 展望

从近些年的研究来看，DWV的寄主范围在不断扩大，DWV变异体和重组热点的出现也威胁着蜜蜂以及新寄主物种的健康与生存。DWV及其变异体的致病机理研究依然是关键，它们是如何影响蜜蜂的健康、繁殖力以及与狄斯瓦螨-蜜蜂的相互作用，有待新技术的开发和应用来深入研究。

目前尚无治疗DWV的药剂，而狄斯瓦螨对DWV的传播起到至关重要的作用，所以防治狄斯瓦螨是防控DWV的关键。单一的防治手段，往往难以两全生态效益以及经济效益，RNAi技术的应用是防控蜜蜂病毒的很好补充，对资源昆虫的保护和生态环境安全有着十分重要的意义。相信未来病虫害的防治将是多种方式的结合，从而达到更加高效、安全的目的，未来的农业也将向环境友好型不断迈进。