宫江宁，吴 婕，熊 亚

(1.贵州师范大学 化学与材料科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州 贵阳 550018)

0 引言

栀子为一种具有药食两用的传统中药，是茜草科植物栀子成熟干燥的果实，具有解毒利尿凉血、泻火清心除烦的作用，始载于《神农本草经》，在《本草纲目》中也有大量的记载。世界上总共有大约250种，主要栽培在我国中南地区，国外主要分布在东南亚、东亚、南亚、北美等地[1-2]。

栀子多糖为从栀子果实中提取的一种水溶性多糖。多糖的提取可采用热水、碱、酸和乙醇等作为提取溶剂，提取方法主要有浸提法、酶法、超声法、微波法、超临界CO2萃取等[3]。试验表明植物多糖通常具有很多的生物活性，如多糖有抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、免疫调节[6]、降血脂[7]、抑菌[8]、降血糖[9]等作用。目前对栀子的研究主要集中在栀子黄色素[10-12]，栀子甙[13-15]，栀子黄酮[16]等成份的研究，对栀子多糖的研究相对较少。

响应面设计试验中，Box-Behnken模块试验设计是一种常用的方法，可根据试验考察因素和考察指标之间的关系建立数学模型，并自动分析，从中可判断出试验和模型结果的拟合度，还可考察因素之间的交互作用及对考察指标的影响等，广泛用于天然产物成份的提取试验设计中[17-20]。本试验以栀子为原料，研究超声提取工艺中超声时间、液料比、超声功率对栀子多糖提取率的影响。并利用响应面法对其提取工艺参数进行优化，得到栀子多糖的最佳提取条件。并对栀子多糖的抗氧化活性和降血糖能力进行研究，以期为栀子多糖的进一步开发利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栀子：重庆帛霖药业；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)：梯希爱化成工业发展公司；氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate acid), ABTS)：上海源叶生物科技；α-葡萄糖苷酶：Sigma公司；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：Sigma公司。

1.2 仪器与设备

A200S型电子天平：德国赛多利斯集团；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FZ102型微型植物粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；UV2300分光光度计：上海天美科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 栀子多糖的提取

将洗净的栀子干燥粉碎，加入80%乙醇浸泡2 h，以脱去部分色素、油脂、单糖和小分子物质，过滤并干燥备用[21]。称取10 g栀子粉末，加入蒸馏水，用超声波法提取一定时间，先用药筛过滤，再减压过滤，收集滤液并减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，使乙醇的浓度为80%，放入冰箱中沉淀24 h。过滤，并依次用无水乙醇和丙酮清洗多糖沉淀，所得沉淀自然风干，得到栀子多糖。

(1)

1.3.2 栀子多糖提取的单因素试验

根据1.3.1中的试验方法，分别考察不同的超声时间(10 min、40 min、70 min、100 min)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、超声功率(60 W、90 W、120 W、150 W)对栀子多糖提取率的影响。

1.3.3 响应面试验优化

在1.3.2中单因素试验的基础上，根据Box-Behnken设计原理，选取提取时间(X1)、液料比(X2)、功率(X3)这3个因素，以栀子多糖的提取率(Y)作为响应值，运用3因素3水平的响应面分析法设计，对栀子多糖的超声提取工艺进行优化，因素水平表见表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels graph

1.3.4 栀子多糖的活性

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对多糖提取率的影响

考察不同超声提取时间(10 min、40 min、70 min、100 min)对栀子多糖提取率的影响，结果见图1所示。

图1 超声时间对多糖提取率的影响Fig.1 Effects of extraction time on the yield of polysaccharides

由图1可以看出，超声时间在10～70 min内，栀子多糖提取率呈显著增加并达到峰值5.26%，而当时间超过70 min时，提取率反而减小，所以选择提取时间为70 min。这可能是由于提取时间过短，多糖不能充分从栀子药粉内部向周围溶剂里扩散，所以随着超声时间的延长，提取率逐渐提高并达到峰值。但超声时间继续延长，多糖逐渐分解，所以提取率反而降低[32]。

2.1.2 液料比对多糖提取率的影响

考察不同液料比(mL/g)(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)对栀子多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 液料比对栀子多糖提取率的影响Fig.2 Effects of water-material ratio on the yield of polysaccharides

由图2可以看出，栀子多糖提取率随着液料比的增加而增加，但当液料比大于40∶1后，提取率增加的趋势减缓。说明液料比增大能充分地将有效成份提取出来，使植物细胞内部与外部溶剂间产生较大的浓度差，用水来提取栀子多糖的过程，实际上是栀子中的多糖向水中扩散的过程，当溶剂的用量增加，有利于多糖的扩散速度，多糖分子的溶出率也会提高[33-34]，并逐渐会达到平衡的状态，从图2中可以看出在40∶1附近栀子多糖达到了平衡态。所以选择液料比为40∶1(mL/g)。

2.1.3 功率对多糖提取率的影响

考察不同超声功率(60 W、90 W、120 W、150 W)对栀子多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 功率对栀子多糖提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

由图3可以看出，栀子多糖提取率随着功率的增加，先呈现增加的趋势，当功率为120 W时，提取率达到最大，为6.32%。但超过120 W后，提取率反而略有减小。这可能是由于功率太大，栀子多糖容易造成分解而使提取率减小[35]。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

响应面试验结果如表2所示，利用Design Expert 10软件对表2的数据进行统计分析，对各因素回归拟合，建立二次响应面回归方程为：

Y=6.28+0.020X1+0.19X2+0.15X3+0.045X1X2-0.030X1X3-0.090X2X3-0.19(X1)2-0.24(X2)2-0.36(X3)2

该回归模型中的一次项X2和二次项X22﹑X32对提取率的影响极显著，二次项X12和一次项X3对提取率的影响显著。各因素之间的交互作用不大，各因素对多糖提取率的影响大小顺序为：提取时间液料比(X2)>功率(X3)>提取时间(X1)。

表2 Bex-Behnken试验设计与结果Tab.2 Bex-Behnken design with experimental result

表3 回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应面最优结果

曲线的走势越陡，说明该因素对栀子多糖的提取率影响越大，而曲线的走势越平缓则说明该因素对栀子多糖提取率的影响较小[36]。从图4可以看出，对栀子多糖提取率影响最大的因素是料液比，其次是功率和提取时间，这和表3中的分析结果相一致。由回归模型预测的栀子多糖最佳提取工艺条件为提取时间为72.55 min，液料比为43.63∶1(mL∶g)，功率为124.64 W，最大提取率预测值为6.33%。为了方便操作，将优化的条件改为提取时间为73 min，液料比为44∶1(mL∶g)，功率为120 W，在此优化条件下进行3次平行试验，栀子多糖的提取率为(6.34±0.09)%，这和预测值较接近，因此该模型可较好地预测和模拟栀子多糖的产率及最佳的提取工艺。

图4 各因素交互影响多糖得率的响应面图Fig.4 Response surface plot for the mutual effects of three variables on yield of polysaccharides

2.3 栀子多糖的活性

2.3.1 栀子多糖对ABTS+·的清除作用

栀子多糖对ABTS+·的清除能力见图5，从图5中可以看出随着栀子多糖的加入量的增多，清除率也随之增大，呈现明显的量效关系。以栀子多糖浓度(5～2 000 mg/mL)和维生素C浓度(5～40 mg/L)对ABTS+·的清除率做拟合，其相关系数均大于0.9，得到栀子多糖的IC50为1 210 mg/L，维生素C的IC50为20 mg/L，表明栀子多糖对ABTS+·有一定的清除能力，但其清除效果小于同浓度的维生素C。

图5 栀子多糖清除ABTS+·的能力Fig.5 Scavenging effect of polysaccharide from Gardeniae on ABTS+·

2.3.2 栀子多糖对DPPH·清除作用

栀子多糖对DPPH·清除能力见图6，由图6中可以看出随着栀子多糖加入量的增多，清除率也随着增大，且浓度超过500 mg/L以后，清除率增大的趋势开始减缓，维生素C浓度大于500 mg/L以后，对DPPH·清除作用的清除率基本没有变化，已达到了最大清除率。以栀子多糖浓度(5～10 000 mg/L)和维生素C浓度(5～100 mg/L)对DPPH·的清除率做拟合，其相关系数均大于0.9，得出栀子多糖的IC50为430 mg/L，维生素C的IC50为46 mg/L。由清除率的趋势和IC50值可以看出，栀子多糖对DPPH·有一定的清除能力，而维生素C对DPPH·的清除能力远远大于栀子多糖。

图6 栀子多糖清除DPPH·的能力Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide from Gardeniae on DPPH·

2.3.3 栀子多糖对OH·的清除作用

栀子多糖对OH·清除能力见图7，由图7中可以看出随着栀子多糖加入量的增多，清除率也增大，维生素C对OH·的清除能力略高于栀子多糖。以栀子多糖浓度(5～10 000 mg/L)和维生素C浓度(5～500 mg/L)对OH·的清除率做拟合，得出栀子多糖的IC50为310 mg/L，维生素C的IC50为240 mg/L。表明栀子多糖对OH·有一定的清除能力，且清除效果与同浓度的维生素C相当。

图7 栀子多糖清除OH·的能力Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide from Gardeniae on OH·

图8 栀子多糖清除的能力Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide

2.3.5 栀子多糖总还原能力

从图9可以看出栀子多糖和维生素C的总还原能力与样品浓度的量效关系。浓度增高，栀子多糖和维生素C的总还原能力均为升高的趋势，但栀子多糖的总还原能力小于同浓度的维生素C。当维生素C的浓度为10 000 mg/L时，吸光度已经达到3.015，而栀子多糖的吸光度只有1.18。

图9 栀子多糖的总还原能力Fig.9 Reducing power of polysaccharides from Gardeniae

2.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

以阿卡波糖作为阳性对照，检测栀子多糖的降血糖活性，结果如图10。由图10可以看出，随着栀子多糖添加浓度的提高，对α-葡萄糖苷酶抑制也随之提高，当多糖浓度大于8 000 mg/L时，抑制率的增加趋势变缓。当多糖浓度范围在2 000～8 000 mg/L内，浓度和抑制率呈现一定的线性关系，回归方程为y=6.541 8x+39.867(R2=0.999 9)，算出其IC50值为1 550 mg/L。这表明栀子多糖具有一定抑制糖吸收的功效，但与阿卡波糖相比，栀子多糖的降糖活性弱于阳性对照。总体上栀子多糖具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

图10 栀子多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.10 Inhibition rate of polysaccharides from Gardenia on α-glucosidase

3 结论

采用Box-Behnken中心组合设计对栀子多糖的提取工艺优化方案可行。优化的工艺参数为：提取时间为73 min，液料比为44∶1(mL/g)，功率为120 W，在此条件下，栀子多糖的提取率为(6.34±0.09)%，验证的试验结果表明优化工艺可行。