樊国燕， 黄 慧， 李慧娟， 张立恒， 娄 飞， 王晓琳， 裴亚玲， 李荣誉

(河南牧业经济学院， 河南 郑州 450046)

抗菌药物为畜禽健康养殖提供了重要保障，但大量、广泛使用甚至滥用抗菌药物导致强耐药性的细菌出现和传播，给公共卫生健康带来巨大威胁。沙门氏菌、弯曲菌及金黄色葡萄球菌是感染畜禽的三类主要食源性致病菌，且畜禽源分离株对常用抗菌药物的耐药率已处于较高水平[1]。范忠军等[2]研究表明， 56株鸡源肠炎沙门氏菌分离株对22种抗生素表现出不同程度的耐药性，其中对青霉素和红霉素的耐药性分别高达98.21%和96.43%。沈学怀等[3-5]研究均证实沙门氏菌(Salmonella)对大部分抗菌药物的耐药情况严重。 2017年主要临床分离菌种分布前20位中，沙门氏菌排第19位，并且近几年均排在前20位[6]。沙门氏菌的耐药性问题在国外同样引起重视，WHITE等[7]研究发现，美国肠道沙门氏菌亚种I型是与人类沙门氏菌病相关的5种最常见细菌型之一，主要表现为对氨苄西林、链霉素、磺胺类药物和四环素的耐药性，已成为一个公共卫生问题。WHITE等[7]调查发现，沙门氏菌确诊和疑似感染源为活的动物环境、肉类和家禽以及宠物等，通过对食品安全和检验服务(FSIS)监管的肉类和家禽产品的分离物进行研究，在多个FSIS产品类别中均发现了低水平的耐药沙门氏菌，表明该病原体的宿主范围相对较广。为探究沙门氏菌的耐药机制，黄慧等[8]对18株临床分离的沙门氏菌进行药敏试验及基因分子特征分析发现，有4株为耐药菌株，耐药率22.2%，说明沙门氏菌对恩诺沙星产生耐药性与gyrA基因突变密切相关，gyrA基因喹诺酮耐药区(QRDR)的双突变可使沙门氏菌对恩诺沙星的耐药性增强。

为探求解决细菌耐药性问题，人们不断寻找抗生素替代品，具有抗菌作用的中药有望成为兽用抗菌药物替代品之一。不过许多中草药虽然具有抗菌活性，但单独应用起效较慢，抗菌活性相对不强，中药单独用于兽医临床效果还不太理想，中药与抗菌西药合理联合应用可以提高疗效，降低化学合成抗菌药物或抗生素的用量，消除或逆转耐药现象[9]，可取得单独使用中药或抗菌药所不能取得的治疗效果。药物组合可以帮助有机体对抗多重耐药(MDR)细菌感染[10]。为探索中药、西药联合应用的抑菌效果，以鸡源沙门氏菌为试验菌株，选用黄芩、黄连、大黄、恩诺沙星、盐酸环丙沙星、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星几种药物，分别单独或采用不同中西药组合进行体外抑菌效果试验，以期筛选出与西药具有协同抗菌作用的中药，为兽医临床用药提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1中药和西药品种中药品种3个，分别为黄芩、黄连和大黄，均购自北京同仁堂大药房。西药品种4个，分别为恩诺沙星(含量99.5%，批号DK03-1806235，上虞京新药业有限公司)，盐酸环丙沙星(含量88.5%，批号DK15-1712241-6，上虞京新药业有限公司)、硫酸阿米卡星(653 U/mg，批号 20160413，浙江永宁药业股份有限公司)、硫酸新霉素(651 U/mg，批号 201708007，宜昌三峡制药有限公司)。

1.1.2试验菌株鸡源沙门氏菌菌株，由河南农业大学牧医工程学院兽医药理学实验室从河南地区养殖场分离、鉴定、保存。质控菌大肠杆菌(ATCC®25922)由河南农业大学馈赠。

1.1.3主要仪器可见分光光度计(型号VIS-7220G，北京莱伯泰科仪器有限公司)，立式高压蒸汽灭菌锅(型号LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂)，分析天平(型号BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司)，振荡培养箱(型号YKC-100B)，恒温培养箱(型号LRH-250)，洁净工作台(型号JJ-CJ-2FD)，96孔V型板，微量移液枪(100 μL、200 μL、1 000 μL)，八连排枪 200 μL。

1.2方法

1.2.1中药水提液制备采用水煎法制备中药水提液，将黄芩、黄连、大黄各取100 g，加纯化水1 000 mL，浸泡30 min，煎煮1 h，纱布过滤；滤液保存，滤渣加纯化水600 mL，煎煮30 min，纱布过滤；合并两滤液，文火浓缩至100 mL，得浓度为1 g/mL的药液；高压灭菌，冰箱4℃保存备用。

1.2.2西药药液制备精密称取硫酸新霉素、硫酸阿米卡星、盐酸环丙沙星适量，分别置于50 mL容量瓶中，用适量水溶解，定容；精密称取恩诺沙星适量，置于50 mL容量瓶中，加入1/2体积的水后，逐滴加1 mol/L的NaOH至最终溶解，加水定容；新霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星计，药物最终浓度均为1 280 μg/mL。药液配成后，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装在EP管内，冰箱4℃保存备用。

1.2.3菌种复苏及菌液制备

1) 菌种复苏。取沙门氏菌菌种 50 μL接种于5 mL的LB 肉汤中，于35℃、220 r/min震荡培养过夜，得复苏菌液；挑取新鲜复苏的菌液接种于LB琼脂培养板上，35℃倒置培养16～18 h，菌种复苏。

2) 菌液制备。菌种复苏后，用接种环蘸取3～4 个单菌落接种于LB肉汤，于35℃、220 r/min 震荡培养8～12 h，培养过程中，每隔20 min用紫外分光光度计测1次菌液的OD625值；当菌液OD625值在0.08～0.13时(菌液浓度约为 1×108cfu/mL)，将菌液用MH 肉汤按 1∶1 000 稀释，备用。

1.2.4单药最小抑菌浓度(MIC)测定及结果判定采用96孔V型灭菌反应板，用微量肉汤二倍稀释法[11]测定黄芩、黄连、大黄、恩诺沙星、盐酸环丙沙星、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星对鸡沙门氏菌的单药最小抑菌浓度(MIC)值，同法测定质控菌的MIC值，重复3次。以美国临床和实验室标准协会(CLSI)动物源细菌抗菌药物敏感性试验执行标准(2017年版)[12]为参考(表1)，比较质控菌对西药的MIC值是否符合要求，判定试验菌株对抗菌药的敏感性。参照李东等[13]的判定标准判断试验菌株对中药的敏感性，MIC>250 mg/mL为不敏感，MIC在125～250 mg/mL为低敏，MIC15.63～62.5 mg/mL为中敏，MIC≤7.81 mg/mL为高敏。根据4种西药对质控菌的MIC测定值，均在质控菌MIC允许范围内，说明试验条件符合要求。

表1 受试菌对4种西药敏感性及判定标准

1.2.5联合用药部分抑菌浓度(FIC)指数测定与结果判定采用微量肉汤棋盘稀释法[11]测定联合用药的FIC指数。根据测得的单药对试验菌株的MIC值，以抗菌药MIC的16倍、8倍、4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍浓度分别进行联合，并设中药、西药单药对照及细菌对照，测定联合用药对鸡沙门氏菌的抗菌效果，以FIC指数为联合药敏试验的判断依据。判断标准[14]：FIC指数≤0.5为协同作用，0.52为拮抗作用。

2结果与分析

2.1沙门氏菌对抗菌中药和西药的敏感性

从表2看出，试验菌株对选用的抗菌西药硫酸新霉素、硫酸阿米卡星比较敏感，对恩诺沙星、盐酸环丙沙星均表现耐药。说明一些抗菌药物已经出现了耐药现象，所以在临床上应考虑抗菌药物的选择及其合理应用，以减轻细菌的耐药。试验菌株3种抗菌中药敏感程度不同，其中，黄连的抗菌效果最佳，属于高敏；黄芩次之，大黄也具有一定的敏感性。由此看出，选用中药作为抗菌药是可行的，但在临床上对于中药抗菌药物的选择时，应进行药物敏感性试验，以达到理想的抗菌效果。

表2 鸡沙门氏菌对抗菌西药和中药的敏感性

2.2抗菌中药和西药联合使用对沙门氏菌的抗菌作用

从表3看出，4种抗菌西药与3种抗菌中药组成的药物组合中，呈协同作用的有3组，分别为恩诺沙星+黄芩，恩诺沙星+黄连和盐酸环丙沙星+黄连；呈相加作用的有2组，分别为硫酸新霉素+黄连和硫酸阿米卡星+黄连；呈无关作用的有2组，分别为恩诺沙星+大黄和盐酸环丙沙星+大黄；其余4组表现为拮抗作用。由此看出，抗菌西药与抗菌中药联合应用对病原菌的抗菌效果有协同相加、无关和拮抗作用。因此，在临床药物选择上，应考虑药物之间的合理配置，充分发挥中、西药联用的抗菌效果。

表3 抗菌中药与西药联用对鸡源沙门氏菌的抗菌效果

3结论与讨论

细菌耐药性已越来越引起人们的关注，且政府部门也采取了相应的措施，禁抗、限抗已提上日程。为此，加大细菌耐药性机制的研究，建立快速检测方法，筛选抗菌中药均不失为一种很好的应对措施。中药作为我国的瑰宝，在畜禽养殖方面的应用也日趋广泛，其抗菌活性的研究重视度也越来越高。研究结果显示，黄芩、黄连、大黄对鸡源沙门氏菌均具有一定的体外抑菌效果，但敏感程度不同，与倪吉荣[15]的研究结论相同。王明英等[16]研究也证实，杜仲叶提取液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌敏感程度不同，而对变形杆菌和枯草杆菌不敏感。由于不同的中药其敏感程度不同，在选择中药作为抗菌药时，应根据不同的致病菌选择不同的中药，同时对其抑菌效果进行考察，以确保治疗效果，为兽医临床上选择中药抗菌药提供参考依据。

中药与西药联用试验结果出现了协同、相加、无关甚至拮抗的情况。朱利霞等[17]分析中草药与抗生素联用对狐狸源大肠杆菌的体外抑菌效果，也出现了相同情况。王洪彬等[18]进行的中西药联用对舌鳎源嗜水气单胞菌的体外抑菌效果研究，则出现了拮抗、无关、相加，没有出现协同效应，与笔者等进行的的硫酸阿米卡星与黄芩、黄连、大黄3种中药联用试验结果类似。而硫酸新霉素、硫酸阿米卡星分别与大黄、黄芩联用后出现拮抗作用，原因可能是2种药混合，发生了物理或化学性质的改变，其产生的机理还需进一步研究。中西药联用不一定都会出现协同作用，BROCHADO等[19]认为，拮抗作用仅发生在靶向不同细胞进程的药物之间，而协同作用经常发生在靶标相同细胞过程的药物之间。据此推断，产生无关或拮抗作用的原因可能是2种药物的作用位点不同所致。在中西药联合应用时，应进行FIC指数检测，以选择具有协同作用的药物组合，进而达到理想的抑菌效果。

中药抗菌药一直被认为是安全低残留的药物，且是限抗、减抗替代品的最佳选择。但张炳亮等[20]研究表明，其研究的23株猪源大肠杆菌对测试的中药均有不同程度的耐药性，试验菌株对甘草耐药率高达82.6%，生地耐药率达78.2%。研究虽未出现中药耐药的情况，但理论上出现中药耐药性是可能的。据此可以看出，中药使用不当，同样会出现耐药情况。因此，在使用中药作为抗菌药时对其产生的耐药性也应引起高度重视。

致谢：试验部分内容由河南牧业经济学院动物药学专业学生马佩文、王磊磊完成，在此一并感谢！