于亚辉， 陈沁雯， 李晓婷， 方婷

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

鸡肉是中国最受欢迎的肉类产品之一。2017年中国鸡肉产量约为1 160万t，2018年则增长到1 215万t，年增长产量4.7%，约占全球鸡肉产量的12.86%。鸡肉加工有多种方式，其中炖汤最为普遍。鸡汤中不仅含有肌肽、肌酸等具有生理活性的小分子化合物，还富含维生素、矿物质、游离氨基酸和蛋白质等物质，易于被人体吸收，具有营养丰富且风味独特的特点[1-4]。鸡肉富含蛋白质且脂肪含量较低，经蛋白酶酶解后产物以多肽和L型游离氨基酸为主。鸡肉酶解液含有与鸡汤相似的滋味与营养物质，同时制作简单，不需要经过熬制等复杂工序，经处理后可以作为保健品原料和鲜味调料，具有较高的营养价值和工业利用价值[5-8]。通过对不同品种鸡熬制的鸡汤味道研究发现，游离氨基酸的种类和含量是影响滋味的重要原因[9]。因此，对比分析鸡汤和鸡肉酶解液的组成成分和相对含量，寻找合适的氨基酸比例，将有助于热反应鸡肉味香精等咸味香精的开发和制备，对鸡肉酶解液的实际应用十分重要。近年来相关研究多以鸡肉酶解工艺优化为主。安攀宇等[10]通过优化鸡肉蛋白酶酶解工艺，得到的酶解液水解度高达32.71%。肖作兵等[11]结合美拉德反应产物的风味评价，采用双指标响应面法进行优化，制备出风味较佳的鸡肉风味基料。在酶解产物研究方面，邱燕翔等[12]发现经酶解后的鸡肉酶解液中游离氨基酸跟寡肽可达99.85%。陈海涛等[13]、张永生等[14]发现不同酶解条件下鸡肉蛋白酶解液对热反应产物的呈味特性影响较大。侯佰慧等[15]研究了热处理对鸡肉酶解液中氨基酸组成的影响及热反应中呈味物质的变化，发现随着加热时间的延长，鸡肉酶解液中游离氨基酸和呈味氨基酸含量增加，其中苦味氨基酸较高。而在与鸡汤成分对比中，陈怡颖等[16]通过将动物蛋白酶和复合蛋白酶分步混合酶解鸡肉后发现，鸡肉酶解液中游离氨基酸总量高于鸡汤，同时鸡汤中鲜味和甜味氨基酸比例较高，而鸡肉酶解液中苦味氨基酸比例较高。但该研究采用的是分步混合酶解法，并未对不同品种蛋白酶的酶解产物分别进行对比分析，且所用蛋白酶的种类只有2种，种类较少，限制了鸡肉酶解液的应用范围。因此,本研究采用6种蛋白酶对鸡肉进行酶解，然后基于主成分分析法(principal component analysis,PCA)对鸡汤及不同鸡肉酶解液中游离氨基酸组成及相对含量进行对比分析，旨在扩展鸡肉蛋白酶解液的应用范围，并为其在热反应咸味香精等实际生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鸡胸肉购自福州永辉超市。复合蛋白酶(1.667 mkat·g-1)、木瓜蛋白酶(13.336 mkat·g-1)、碱性蛋白酶(3.334 mkat·g-1)、风味蛋白酶(0.333 4 mkat·g-1)、中性蛋白酶(1.000 2 mkat·g-1)均购自北京索莱宝试剂公司；动物蛋白酶(5.001 mkat·g-1)购自南宁庞博生物工程有限公司；孔径0.45 μm滤膜购自天津津腾实验设备有限公司；其余试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备 鸡汤的制备：选用新鲜鸡胸肉，剔去残留的结缔组织及脂肪组织，清洗干净后切丁(长2 cm，宽2 cm)，经100 ℃沸水焯后放入高压锅(MY-CS50C，美的电器)中按照m(鸡肉)∶V(H2O)=1∶4加水，在炖汤模式下加热2.5 h[17]，之后冷却捞掉鸡肉并撇去悬浮物，在2 ℃下置于高速冷冻式离心机(Centrifuge 5430R，德国艾本德股份公司)，6 000 r·min-1离心15 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后保存待测。

酶解液的制备：选用新鲜鸡胸肉，剔去残留的结缔组织及脂肪组织，清洗干净后切丁(长2 cm，宽2 cm)，按照m(鸡肉)∶V(H2O)=1∶4加水后经破壁机(JYL-Y99，九阳电器)打浆，放入烧杯内分别加入6种蛋白酶(动物蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶)，根据酶制剂厂家提供的酶解条件，选定酶解的最适pH与最适温度，在恒温磁力搅拌器(DF-101SZ，巩义市豫华仪器有限责任公司)进行酶解，酶解时间持续6 h，具体设置见表1。酶解后升温至100 ℃保持10 min，得到鸡肉酶解液，在2 ℃下置于高速冷冻式离心机，6 000 r·min-1离心15 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后保存待测。

表1 不同蛋白酶酶解最适pH与最适温度Table 1 Optimum pH and temperature of enzymolysis with different proteases

1.2.2 不同蛋白酶对鸡肉酶解进程曲线 为了对比分析常用蛋白酶对鸡肉的酶解能力及特性，设定加酶量为0.9%[13]。酶解试验条件见1.2.1，总酶解时间持续6 h，每隔1 h测定水解度，建立不同蛋白酶的酶解进程曲线，确定酶解时间。

1.2.3 鸡肉蛋白酶解液水解度的测定 参考陈海涛等[13]的方法，按照下式计算水解度：

(1)

式中:N0为总氮含量，N1为酶解前游离氨基态氮含量，N2为酶解后游离氨基态氮含量。

1.2.4 游离氨基酸的测定 采用全自动氨基酸分析仪(L-8900，日立高新技术公司)检测游离氨基酸[18]。检测参数：日立离子交换树脂(4.6 mm×60.0 mm)；测定波长为570、440 nm；缓冲液流速0.5 mL·min-1；柱温20～85 ℃；进样量20 μL。测时样品各稀释10倍，平行测定3次。混合标样包括氨基酸、小肽及含氮小分子物质，共38种，其中游离氨基酸17种，其余21种。

1.3 数据分析

每个样品进行3次测定，游离氨基酸含量表示为出峰面积，相对含量取平均值。采用Unscrambler X 10.4进行差异性及主成分分析，其余采用Origin 2017制图。

根据峰面积大小来确定组成成分及游离氨基酸的相对含量，各样品的组成成分及游离氨基酸采用相对含量进行对比分析，具体公式如下：

(2)

式中：P为相对含量，Si为各样品组成成分物质峰面积，S为各样品总峰面积。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对鸡肉酶解进程曲线

6种蛋白酶对鸡肉的酶解能力如图1所示。随着时间的增加，蛋白酶水解度上升，增长速度呈现先增加后减少的趋势，在酶解4 h后水解度的增长速度逐渐变慢。碱性蛋白酶酶解鸡肉的水解度在5 h时出现了大幅增长，推测是在进一步酶解过程中出现了含有更多丝氨酸残基和磷酸化丝氨酸残基的多肽序列，释放出更多的氨基酸和多肽。综合考虑蛋白酶在实际生产中的应用情况及其他酶的酶解情况，本文选定4 h为目标酶解时间进行研究。此时动物蛋白酶水解度为19.21%，木瓜蛋白酶水解度为16.96%，风味蛋白酶水解度为13.65%，复合蛋白酶水解度为18.52%，碱性蛋白酶水解度为14.06%，中性蛋白酶水解度为11.62%，这表明，动物蛋白酶的酶解效果最好，其次为复合蛋白酶，而中性蛋白酶的酶解效果最差。

图1 不同蛋白酶对鸡肉酶解进程曲线Fig.1 Process curves of different proteases on chicken enzymolysis

2.2 鸡汤及鸡肉酶解液组成成分分析

由表2可知，鸡汤及鸡肉酶解液中均检测出大量游离氨基酸及小分子物质，但组成成分与相对含量均有所差异。对比组成成分可知，鸡汤中检测到33种物质，酶解液中共检测到36种物质。磷酸乙醇胺和胱硫醚是鸡汤中特有的物质，而磷酸丝氨酸、牛磺酸、肌氨酸、Β-氨基异丁酸和鹅肌肽则在鸡汤中未检测到。与鸡肉酶解液相比，鸡汤中尿素、肌肽和羟脯氨酸较多，而赖氨酸较少，差异显著(P<0.05)。对比相对含量可知，鸡汤中γ-氨基丁酸相对含量最高为7.64%，精氨酸相含量最少为0.92%；动物蛋白酶酶解液中赖氨酸相对含量最高为13.67%，肌氨酸相对含量最少为0.09%；复合蛋白酶酶解液中亮氨酸相对含量最高为11.10%；尿素相对含量最少为0.03%；木瓜蛋白酶酶解液中氨相对含量最高为14.35%，尿素相对含量最少为0.19%；碱性蛋白酶酶解液中氨相对含量最高为7.10%，肌氨酸相对含量最少为0.01%；风味蛋白酶酶解液中1-甲基组氨酸相对含量最高为18.24%，苯丙氨酸相对含量最少为0.16%；中性蛋白酶酶解液中1-甲基组氨酸相对含量最高为14.52%，γ-氨基丁酸相对含量最少为0.06%。

表2 鸡汤及鸡肉酶解液中组成成分及相对含量

2.3 鸡汤及鸡肉酶解液中游离氨基酸呈味特性分析

游离氨基酸是影响鸡汤和鸡肉酶解液风味的重要因素，其呈味特性由游离氨基酸自身结构决定，主要分为鲜味、甜味和苦味3类[19-20]。在鸡汤和鸡肉酶解液组成成分中，选择17种游离氨基酸进行对比分析，并根据峰面积得到各游离氨基酸在17种游离氨基酸中的相对含量。由表3可知，17种游离氨基酸包括鲜味氨基酸2种，甜味氨基酸5种，苦味氨基酸9种，其他氨基酸1种。鸡汤与鸡肉酶解液中呈味氨基酸相对含量差异较大。鲜味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸，是影响样品鲜味的关键物质，鸡汤中鲜味氨基酸相对含量为13.31%；甜味氨基酸相对含量为27.57%，其中丙氨酸、丝氨酸及苏氨酸含量较高；苦味氨基酸相对含量为56.71%，其中组氨酸含量较高，达到13.77%；胱氨酸由于含有二硫键，会产生令人不悦的味道，在鸡汤中相对含量较低，为2.41%。动物蛋白酶酶解液中鲜味氨基酸与鸡汤中相对含量最接近，为13.11%，但是谷氨酸与天冬氨酸相对含量与鸡汤相比差异显著(P<0.05)；复合蛋白酶酶解液中鲜味氨基酸同样与鸡汤中相对含量相近，为10.95%，且谷氨酸与天冬氨酸相对含量与鸡汤相比差异不显著(P>0.05)；木瓜蛋白酶酶解液中鲜味氨基酸相对含量略高于鸡汤，相对含量为14.03%，谷氨酸与天冬氨酸相对含量与鸡汤相比差异不显著(P>0.05)，但胱氨酸相对含量为10.93%；碱性蛋白酶酶解液中，鲜味氨基酸相对含量最少，为5.35%；风味蛋白酶酶解液中鲜味氨基酸及甜味氨基酸的相对含量较高，达到18.98%及43.59%，但苦味氨基酸相对含量仅为29.51%，是鸡汤和鸡肉酶解液中最低的；中性蛋白酶酶解液中苦味氨基酸相对含量较高为66.88%，但胱氨酸相对含量仅为0.32%，是鸡汤与鸡肉酶解液中最低的。

2.4 鸡汤及鸡肉酶解液中游离氨基酸的PCA分析

主成分分析法是重要的降维分析方法，在对多样本复杂数据进行降维后，可使用包含主要信息的主成分来替代原始数据进行分析，在原始数据不失真的条件下可反映出较多的样本信息，以期对数据进行全面分析[21-22]。鸡汤与不同鸡肉酶解液中氨基酸数目与相对含量较为离散，对表3数据进行标准化处理，然后采用PCA分析，对不同样品间的差异性及相似性进行评价，结果如图2所示。第一主成分(PC-1)和第二主成分(PC-2)贡献率分别占53%和21%，累计贡献率为74%，包含了大部分原始信息，符合主成分分析的需要。由图2-A可知，样品F在第一象限，样品A、D、E在第二象限，样品C在第三象限，样品B、P在第四象限。不同的游离氨基酸聚集在不同的样品附近，表明不同的样品中游离氨基酸的组成具有一定的差异。由图2-B可知，与样品F位于同一象限的游离氨基酸有苯丙氨酸和脯氨酸，与样品A、D、E位于同一象限的游离氨基酸有甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸和赖氨酸，与样品C位于同一象限的游离氨基酸有缬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸和酪氨酸，与样品B、P位于同一象限的游离氨基酸有异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸和苏氨酸。相比较其他样品，样品P和B位于同一象限，游离氨基酸种类和相对含量差异相对较小，同时呈味特性类似，因此鸡汤与复合蛋白酶酶解液具有相似的滋味。

注：A为分数图，表示每个主成分的权重；B为相关载荷图，表示各个自变量的加权关系。

3 结论与讨论

本研究采用氨基酸自动分析仪对鸡汤中的游离氨基酸和其他小分子物质进行了分析，除检测到多种游离氨基酸外，还检测到肌肽等小分子活性物质的存在，与何蓉蓉等[5]研究结果一致。酶解是制备功能性蛋白质、活性肽及游离氨基酸的重要途径，蛋白质经酶解后营养价值更高，在生物医药、食品等行业有着广泛应用。蛋白酶具有专一性，不同蛋白酶对鸡肉酶解液中游离氨基酸及小分子物质的组成成分产生影响。本研究选用6种不同的蛋白酶对鸡肉进行酶解4 h，结果发现：动物蛋白酶的酶解效果最好，水解度为19.21%，其次为复合蛋白酶，水解度为18.52%，而中性蛋白酶的酶解效果最差，为11.62%。由于这类蛋白酶中包括内切酶、外切酶和复合酶，作用机理都较为复杂，但整体上具有多作用位点的复合蛋白酶对鸡肉的酶解效果较好。

本研究对比分析了鸡汤和不同鸡肉酶解液中组成成分和相对含量，发现鸡肉酶解液中游离氨基酸及小分子物质总量高于鸡汤。从鸡汤中检测到33种物质，在鸡肉酶解液中共检测到36种物质。此外，与鸡肉酶解液相比，鸡汤中组氨酸、尿素、肌肽和羟脯氨酸较多，而赖氨酸较少，差异具有显著性(P<0.05)。鸡肉经煮制后，蛋白质发生热降解，肽酶作用于肽链，催化出游离氨基酸及小肽，由于蛋白酶的作用位点不同，以及从鸡肉中自然浸出的物质不同，使得鸡汤与鸡肉酶解液中物质相对含量具有差异性。对鸡汤和鸡肉酶解液中的17种游离氨基酸进行对比分析，发现组氨酸、谷氨酸及酪氨酸是鸡汤中主要的游离氨基酸。呈味氨基酸种类及相对含量的不同会对样品滋味产生影响，结合呈味氨基酸的阈值可确定呈味氨基酸对样品滋味形成的贡献[23-24]。鸡汤中呈鲜味和呈甜味氨基酸占总游离氨基酸的40.88%，赋予鸡汤一定的鲜甜味；同时苦味氨基酸占总游离氨基酸的56.71%，与鸡肉酶解液相比相对含量较低，这也决定了鸡汤与鸡肉酶解液的滋味不同。动物蛋白酶酶解液中，呈鲜味和呈甜味氨基酸相对含量较高，为46.13%，苦味氨基酸相对含量较少，为43.04%，推测是因为动物蛋白酶通常由蛋白内切酶、外切酶和风味酶等组成，内切酶作用于肽链的中间部分，外切酶作用于肽链的末端从而使氨基酸切出游离出来，风味酶则对呈味氨基酸进行调节可优化酶解液风味，因此动物蛋白酶对蛋白质整体酶解效果较好，有效利用率较高且风味也较好。复合蛋白酶是杆菌蛋白酶复合物，也是内切杆菌蛋白酶的复合体，其酶解液中苦味氨基酸相对含量为60.63%，与鸡汤中的56.71%相差最小。木瓜蛋白酶酶解液中胱氨酸相对含量较高为10.93%，可能原因是木瓜蛋白酶是植物蛋白酶，属于含巯基肽链内切酶，可以特异性切开包含巯基的肽链。碱性蛋白酶酶解液中丝氨酸相对含量较高为13.82%，可能原因是碱性蛋白酶是由地衣芽孢杆菌经发酵而提炼出来的蛋白水解酶，是丝氨酸型的内切蛋白酶。风味蛋白酶酶解液中呈鲜味和呈甜味氨基酸占总游离氨基酸的62.57%，是所有样品中最高的，苦味氨基酸仅占29.51%，说明风味蛋白酶可以有效酶解鸡肉中的苦味多肽改善酶解液风味，提高蛋白质的利用率。中性蛋白酶酶解液中呈苦味氨基酸占总游离氨基酸的66.88%，是所有样品中最高的，推测是中性蛋白酶切开了氨基端由疏水性或其他氨基残基构成的肽键，尤其对苯丙氨酸等疏水性大分子氨基酸组成的肽键效果较好，而苯丙氨酸等疏水性氨基酸的暴露会增加苦味肽的疏水度，使得酶解液苦味增加。

对鸡汤和不同鸡肉酶解液中17种游离氨基酸进行主成分分析，发现样品分布较为离散，鸡汤与鸡肉酶解液在游离氨基酸种类上差异较小，但在游离氨基酸相对含量上差异显著，这对利用酶解液制备热反应鸡肉香精产生了影响。合适的氨基酸比例是制备热反应鸡肉味香精的重要条件，因此选取合适的蛋白酶进行酶解，以得到所需氨基酸相对含量较高的酶解液就十分重要。对比分析鸡汤与鸡肉酶解液中组成成分的不同，发现复合蛋白酶酶解的鸡肉酶解液中游离氨基酸种类和相对含量与鸡汤差异最小，具有相似的滋味，这为在实际应用中选择合适的目标酶，利用鸡肉酶解液制备鸡肉味热反应型香精提供了理论基础和参考依据。