和春昊， 金钺， 张晨昕， 郭珍珍， 李滨洲， 吴秋玲， 王亚宾，3， 陈丽颖，3

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002； 2.北京化工大学国际教育学院，北京 1022002； 3.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

肠球菌(Enterococcus)是存在于人和动物肠道内的一种常见机会致病菌，也是引起医院内感染的主要原因之一[1]，其中以粪肠球菌(E.faecalis)感染最为常见[2]。作为机体常在菌群成员之一，肠球菌在宿主组织完整性被破坏时，可凭借其毒力因子胶原蛋白黏附素(Adhesin of collagen from Enterococcus, Ace)的辅助黏附、定植于宿主细胞，进而导致人和动物的机会性感染[3-4]。Ace是一种分泌于细菌表面、染色体编码的蛋白质，由721个氨基酸残基构成，参与肠球菌与宿主细胞的胞外基质蛋白(Extracellular matrix proteins, ECM)黏附；它有良好的黏附活性，在菌体生物膜形成过程中起重要作用，并且，Ace可诱导产生具有良好保护性的抗体，因此已成为肠球菌疫苗研发的重点候选抗原。铁蛋白(ferritin)是一个普遍存在于多种微生物到高等动植物体内、相对分子量约为450 ku的中空纳米蛋白笼[5-6]。其组成包括蛋白和铁核两部分，其中蛋白部分也称为脱铁铁蛋白(apoferritin)，由24个亚基通过非共价键结合形成高度对称的中空结构。哺乳动物的铁蛋白亚基主要有H亚基(约21 ku)和L亚基(约19 ku)2种，在哺乳动物不同组织或发育阶段，H/L亚基按照不同比例进行组装，从而构成一个庞大的储铁蛋白家族 (isoferritins)[7-8]。富含L亚基的铁蛋白(肝、脾脏中)含铁量高，存储功能强，而富含H亚基的铁蛋白多存在于心、脑组织中，具有显著的抗氧化活性[9]。

铁蛋白对高温(70～80 ℃)和多种变性剂都比较稳定，但对酸碱度非常敏感，在pH 2.0时铁蛋白笼发生解离，变成游离亚基，而在pH 7.0时又能重新自发组装成蛋白纳米笼[10-11]。更重要的是，铁蛋白自身并无抗原性，但它能增强抗原的免疫原性，提高免疫效果。因此，近年来已有人将铁蛋白作为纳米佐剂应用于疫苗创制并取得了良好效果[11-13]。本研究旨在以铁蛋白H亚基为载体，将该基因与粪肠球菌Ace抗原的不同表位基因片段偶联并进行融合表达，以获得携带抗原表位的自组装铁蛋白纳米笼，然后进行动物免疫接种试验观察其免疫效果。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

携带有粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因ace片段的质粒pET-32a-ace及同时携带铁蛋白H亚基基因的质粒pET-32a-ace-H均由河南农业大学预防兽医系微生物实验室 构建并保存[14]。猪源粪肠球菌Ace阳性血清(一抗)由本实验室制备并保存，羊抗兔IgG-HRP(二抗)购自美国博奥森公司[15]。40 d龄清洁级健康雄性家兔购自河南省实验动物中心。

RT-PCR试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TRIzol、T4DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ与XhoI、蛋白酶抑制剂(PMSF)、Ni-Agarose填料以及2×Taq预混酶均购自康为世纪(北京)生物科技有限公司；蛋白酶K、DNA Marker和10× Loading Buffer均购自大连TaKaRa公司；预测的抗原表位基因DNA片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 重组质粒的构建与鉴定

根据猪源粪肠球菌ace基因序列( GenBank序列号NP_814829.1)，利用常用生物信息学软件预测其抗原表位基因片段[16]，然后将筛选出的6个抗原表位基因序列送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA合成，这些基因序列上下游分别带有BamH I和HindⅢ酶切位点。将上述6个基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接，并插入pET-32a表达载体，构建重组质粒(命名为pET-32a-ace1-H～pET-32a-ace6-H)。同时构建含全长ace基因的重组质粒pET-32a-ace和pET-32a-ace-H。上述重组质粒经双酶切鉴定正确后，进行测序与比对分析。

1.3 融合蛋白的表达与鉴定

将各重组表达质粒分别转入表达菌BL21(DE3)中，以终浓度为0.2 mmol·L-1的IPTG进行诱导表达，8 h后取出菌液，加入PMSF、溶菌酶、Triton X-100后进行超声破碎，然后分别收集上清液和沉淀，煮沸后进行SDS-PAGE检测，以确定重组蛋白的表达效果。各重组蛋白经镍柱纯化，以咪唑缓冲液洗脱后，以抗Ace阳性血清作为一抗、羊抗兔IgG-HRP作为二抗，利用Western blot，以检测抗原蛋白的免疫原性。

1.4 重组铁蛋白纳米颗粒免疫家兔试验

将年龄相同、健康状态一致的清洁级雄性家兔分为6个组，每组3只，分别以抗原蛋白/表位命名，其中Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H组为重组表位铁蛋白纳米颗粒疫苗组，而Ace组和Ace-H组分别为非纳米颗粒对照组和多表位纳米粒对照组，同时设立阴性对照组，不作任何处理。用各“重组融合蛋白+弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂”制备免疫原，分别对家兔进行免疫接种，接种蛋白量为1 mg·只-1，接种途径为背部皮下多点注射。在首免(弗氏完全佐剂)后第2周、第3周和第4周，各进行一次强化免疫接种(弗氏不完全佐剂)，剂量为1 mg·只-1。分别在首次接种当日、首免后第2周、第3周和第4周(加强免疫时)及末次免疫1周时，经耳缘静脉采集各组试验兔血液，分离血清，采用本实验室前期建立的间接ELISA方法[14]检测其血清中抗Ace抗体效价(OD450 nm)，分析各铁蛋白纳米颗粒免疫水平。

1.5 统计学分析

试验所得结果经GraphPad Prism 6软件进行T检验分析，P<0.05代表结果具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建与鉴定

依据筛选出的6个猪源粪肠球菌Ace抗原线性表位合成了相应的基因片段ace1～ace6，依此构建出重组质粒pET-32a-ace1-H ～ pET-32a-ace6-H，将上述6个质粒及pET-32a-ace-H进行BamHI和XhoI双酶切鉴定，结果显示所得到的酶切片段与预期相符(图1)。基因序列测定结果显示，各重组质粒均与GenBank公布的相应序列一致，表明本研究中的7个重组质粒pET-32a-ace-H和pET-32a-ace1-H ～ pET-32a-ace6-H均构建正确。

M:DL 10 000 DNA Marker；1、3、5、7、9、11、13：pET-32a-ace-H、pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace2-H pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace4-H、pET-32a-ace5-H、pET-32a-ace6-H双酶切；2、4、6、8、10、12、14pET-32a-ace-H、pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace2-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace4-H、pET-32a-ace5-H、pET-32a-ace6-H单酶切。

2.2 重组蛋白表达与Western blot分析结果

经SDS-PAGE检测，显示在IPTG诱导下重组质粒pET-32a-ace-H、pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace5-H和pET-32a-ace6-H 均能够在大肠杆菌BL21中可溶性表达，并得到了重组蛋白Ace-H、Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H；而另2种蛋白Ace2-H和Ace4-H则为包涵体形式，故弃去。上述可溶性表达产物经Western blot检测显示均能在各自的目的条带位置出现特异性条带(图2)，表明所获得的纯化重组蛋白均具有较好的免疫原性。

M: 蛋白Marker ；1：Ace1-H；2：Ace3-H；3：Ace5-H； 4：Ace6-H；5：Ace-H。

2.3 重组铁蛋白纳米颗粒免疫家兔后抗体水平检测结果

用携单一抗原表位的重组融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H及携多表位的 Ace-H蛋白及单独的Ace蛋白分别准备免疫原接种家兔后，于不同时间点采集血清并进行ELISA检测。结果显示，上述6种蛋白抗原免疫接种家兔后，均在家兔体内诱导产生了特异性抗体，其血清抗体水平(OD450 nm)消长动态如图3所示。其中，与携带多表位的Ace蛋白以及Ace-H铁蛋白纳米颗粒相比，携带单个Ace表位的铁蛋白纳米颗粒Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H所诱导的抗体效价和变化动态具有较好的一致性，且以铁蛋白纳米粒Ace5-H 的免疫效果为最佳。经T-检验分析结果表明，Ace5-H与阴性对照组组相比差异显著(P<0.05)。几种免疫原的免疫效果具有Ace5-H>Ace-H>Ace>Ace6-H>Ace3-H>Ace1-H的趋势，表明铁蛋白纳米笼能有效增强蛋白质抗原的免疫原性(Ace5-H和 Ace-H)。

3 讨论

疫苗接种是有效预防病原微生物感染的重要手段之一，尤其在当前由于滥用抗生素而导致细菌耐药性日益严重的情况下，更需要研发、推广使用精准、高效、持久又能节约机体免疫潜力的疫苗用于疫病预防，以减少和替代抗生素的使用。表位疫苗是近年来备受重视的一类新型疫苗，它只携带免疫原的抗原表位而非完整分子，具有安全性好、特异性强和节省免疫潜力等优点，但表位疫苗大都存在着相对分子质量较小、免疫原性弱、易分解等缺陷，难以引起机体强烈而持久的免疫应答，因此选择合适的佐剂尤为重要[17-18]。本研究表明，携Ace单一表位及多个表位的重组铁蛋白均能成功自组装，形成与缺铁核铁蛋白基本一致的纳米颗粒。而动物免疫试验结果显示，几种免疫原均能诱导家兔产生特异性抗体水平，其中携单一表位的重组铁蛋白Ace5-H比携多表位的Ace-H的免疫效果似乎更佳。究其原因，有可能是Ace分子量较大导致其结构变化而影响抗体的产生[19]。

图3 不同Ace免疫原接种家兔后的

抗原的有效递呈和特异性抗体的产生取决于抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)的识别与摄取[19-20]。铁蛋白纳米笼相对分子质量较大，有可被修饰的亚基，能够在一定环境下自组装，且具有较高的生物安全性。铁蛋白纳米笼高度对称，进入机体后是树突状细胞、巨噬细胞首选的吞噬目标，更易引起炎症和免疫反应，因此更易于实现抗原识别和递呈[21]。通过基因工程方法把抗原表位片段与铁蛋白亚基偶联，可以提高铁蛋白载体荷载的抗原量，从而解决APC对可溶性抗原摄取量不足的问题，进而增强抗原免疫原性，提高免疫效果。研究表明，用原核表达的方法表达亚基单体，利用在生理环境下自组装，制备出类似天然铁蛋白中空的纳米笼，含三聚体的纳米颗粒免疫家兔能诱导产生更好的抗体免疫应答，保护效果更佳[12]。以铁蛋白作为载体制备的流感病毒血凝素三聚体纳米疫苗，能诱导产生高于传统灭活三聚体疫苗的应答水平[13]。