张伟彪，顾亚萍*，曾定玲，王瑞，林慧纯，尹义捐，方长发

1(深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳，518040)2(广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳，518040)3(深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳，518055)

目前的农药残留检测(以蔬菜水果中农药残留检测为主)有两个趋势，即仪器检测高通量化和样品前处理简便快速化，检测时常用ESI源(或EI源)配合串联四级杆质谱仪，即液相色谱串联四级杆质谱仪(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS-MS)和气相色谱串联四级杆质谱仪(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS-MS)，而在前处理时常使用QuEChERS法[分散固相萃取法， quick(快速)，easy(简单)，cheap(经济)，effective(高效)，rugged(可靠)，safe(安全)]。以LC-MS-MS检测为例，QuEChERS处理后的样品，常用乙腈[1-4]、乙腈+水(体积比1∶1)[5-8]和甲醇+水(体积比1∶1)[9-10]作为样品定容溶剂。在高通量检测时，农药之间、农药和溶剂之间的相互作用势必将成为制约样品检测稳定性的一个重要因素。不同有机溶剂对溶质稳定性的影响，国内仅有少数实验室做过一些研究，大多在气相色谱仪上，且针对的化合物较少[11-15]，对多种有机化合物在LC-MS-MS上的稳定性研究几乎为空白。本文首次将样品定容溶剂作为检测过程的一个关键控制点进行分析探讨，从检测中的标准物质和加标基质的角度，考察LC-MS-MS分析检测中定容溶剂对于标准物质和加标基质长时间稳定性的影响，在此基础上探讨标准物质定容溶剂对于样品测定结果准确度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用韭菜和橙子(韭菜中色素较多，橙子中有机酸较多，都属于检测中基质效应较高的蔬菜水果品种)经实验室检测后得到的空白样品，其中橙子中含有一定浓度的噻菌灵，实验时扣除样品本底值后进行计算。所有样品经打浆装瓶后冷冻于-18 ℃条件下备用。

98种农药标准物质(1 000 mg/L)：涕灭威亚砜、涕灭威砜、多菌灵、吡虫啉、灭多威、啶虫脒、涕灭威、3-羟基克百威、克百威、甲萘威、除虫脲、灭幼脲、辛硫磷、阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、烯酰吗啉、嘧菌酯、噻虫嗪、氟啶脲、咪鲜胺、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果、敌敌畏、三唑磷、二嗪磷、甲拌磷、甲拌磷亚砜、甲拌磷砜、伏杀硫磷、丙溴磷、毒死蜱、灭蝇胺、甲霜灵、霜霉威、多效唑、氯虫苯甲酰胺、醚菊酯、虫酰肼、吡唑醚菌酯、磷胺、蝇毒磷、灭线磷、敌百虫、杀扑磷、硫环磷、茚虫威、克螨特、杀虫脒、霜脲氰、抗蚜威、仲丁威、内吸磷、乙霉威、硫线磷、精甲霜灵、四螨嗪、噻嗪酮、氟硅唑、联苯三唑醇、甲基硫菌灵、噻螨酮、啶氧菌酯、精氟吡甲禾灵、唑虫酰胺、螺螨酯、唑螨酯、氟酰脲、多杀菌素、氟苯脲、氟虫脲、噻虫胺、噻虫啉、丙环唑、杀线威、呋虫胺、粉唑醇、甲基硫环磷、治螟磷、特丁硫磷、特丁硫磷亚砜、特丁硫磷砜、噻菌灵、缬霉威、异菌脲、氟虫腈、氟虫腈亚砜、氟甲腈、氟虫腈砜、马拉硫磷、亚胺硫磷、嗪胺灵、杀螟硫磷、稻丰散、喹硫磷、戊菌唑和氯唑磷，均购自农业部环境保护科研检测所；甲醇、乙腈(均为色谱纯)，德国默克公司；NaCl(分析纯)，西陇化工股份有限公司；甲酸、乙酸铵(均为优级纯)，上海安谱科学仪器有限公司；实验用水为自制超纯水；PSA粉(N-丙基乙二胺固相吸附剂)，购于安捷伦有限公司。

样品提取液上机前经0.22 μm的聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)滤膜过滤至2 mL HP小瓶中。

1.2 仪器与设备

XEVO TQ-S液相色谱串联四极杆质谱联用仪(软件为Masslynx)，美国Waters公司；N-EVAP 112氮吹仪，美国Organomation Associates公司；Elix5纯水机，美国Millipore公司；XH-B旋涡混合器，江苏省姜堰市康健医疗器具有限公司；TG16G台式高速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；AS30600BDT超声波清洗器，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；滤膜和HP小瓶，安捷伦科技有限公司；HY-5回旋式振荡器，江苏省金坛市宏华仪器厂；自动匀浆机AUTO-HOMOGEZER，Hestix Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制

标准储备液A和B(20 mg/L)：将98种农药分为2组(A和B)，其中A组包括阿维菌素、多菌灵、除虫脲、吡虫啉、灭幼脲、辛硫磷、啶虫脒、克百威、3-羟基克百威、灭多威、甲萘威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、涕灭威、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、烯酰吗啉、嘧菌酯、噻虫嗪、氟啶脲、咪鲜胺、甲拌磷亚砜、甲拌磷砜、杀螟硫磷、敌敌畏、甲拌磷、伏杀硫磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、丙溴磷、氧乐果、甲胺磷、乐果、二嗪磷、三唑磷、灭蝇胺、甲霜灵、霜霉威、多效唑、氯虫苯甲酰胺、醚菊酯、虫酰肼、吡唑醚菌酯和丙环唑；B组包括呋虫胺、杀线威、甲基硫环磷、杀虫脒、噻虫胺、噻菌灵、敌百虫、霜脲氰、噻虫啉、硫环磷、磷胺、甲基硫菌灵、抗蚜威、嗪胺灵、粉唑醇、精甲霜灵、杀扑磷、亚胺硫磷、内吸磷、仲丁威、特丁硫磷砜、特丁硫磷亚砜、乙霉威、马拉硫磷、氯唑磷、丙森锌、灭线磷、氟甲腈、异菌脲、氟硅唑、氟虫腈、啶氧菌酯、稻丰散、氟虫腈硫醚、喹硫磷、戊菌唑、治螟磷、氟虫腈砜、蝇毒磷、多杀菌素、联苯三唑醇、四螨嗪、茚虫威、精氟吡甲禾灵、硫线磷、氟酰脲、特丁硫磷、氟苯脲、唑虫酰胺、噻嗪酮、噻螨酮、氟虫脲、克螨特、唑螨酯和螺螨酯。

2组各准确移取标准物质1.00 mL于50.00 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，标准储备溶液于-18 ℃条件下保存备用。

标准工作液：准确移取标准储备液A和B各0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，用甲醇+水(体积比1∶1)定容至刻度线，现配现用。

5 mmol/L乙酸铵+0.5%甲酸溶液：准确称取乙酸铵0.196 g，移取0.25 mL甲酸，加水稀释到500 mL，经超声波清洗器脱气5 min用于仪器流动相用。

甲醇+水(体积比1∶1)。

乙腈+水(体积比1∶1)。

1.3.2 样品处理

将冷冻样品常温下解冻，充分搅匀。准确称取样品(10±0.1) g于50 mL尖底塑料离心管中，加入20 mL乙腈12 000 r/min匀浆2 min。再加入NaCl 3 g，置于摇床下振荡30 min，使充分溶解。将该离心管置于高速离心机中在5 000 r/min离心5 min后，移取上清液2 mL于15 mL离心管中，加入0.1 g PSA置于旋涡混合器上混合1 min，再次置于高速离心机中在4 000 r/min离心1 min。

取上清液1 mL于氮吹仪上50 ℃条件下吹干，可得到各类样品基质。

1.3.3 三种溶剂中98种农药稳定性的研究

准确移取标准储备液A和B(20 mg/L)各0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，分别使用乙腈、乙腈+水(体积比1∶1)和甲醇+水(体积比1∶1)定容，得到3种混合标准工作液(0.080 μg/mL)。

1.3.4 两种基质中3种溶剂对98种农药稳定性的影响

韭菜和橙子样品经1.3.2处理后，分别用1.3.3的所得的3种混合标准物质工作液定容至2.00 mL，得到韭菜和橙子2种溶剂的基质标准溶液。

所有的样品上机时按照标准溶液、基质标准溶液和样品的顺序进样，整个样品检测过程中严格控制样品瓶存放的温度为4 ℃，以减少样品瓶中溶剂的挥发。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 液相色谱条件

Acquity UPLC HSS T3色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流速0.4 mL/min；进样量1 μL(其中乙腈作为溶剂的所有样品进样量为0.5 μL)；柱温 40 ℃；样品室温度：4 ℃；流动相：A盐溶液(5 mmol/L乙酸胺+0.05%甲酸溶液)，B甲醇；流动相梯度：0～1 min ，B 10%～10%;2～3 min，B 25%～25%;5～6.5 min，B 45%～60; 7.5～8.5 min，B 60%～75%;9～10 min，B 80%～90%;11～12 min，B 90%～10%; 12～14 min，B 10%～10%。

1.4.2 质谱条件

电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)：ESI+/ESI-电离模式；毛细管电压:3.5 kV;干燥气温度：450 ℃;干燥气流速:900 L/h:锥孔气流速:150 L/h;雾化压力:7 Bar;碰撞气流速:0.15 mL/min。

98种农药质谱检测参数详见表1。

表1 98种农药的液质质多离子扫描检测参数

续表1

续表1

2 结果与分析

2.1 三种溶剂中98种农药稳定性的研究

3种溶剂乙腈、乙腈+水和甲醇+水作为常用的定容溶剂，在LC-MS-MS检测中都有广泛的使用。

其中乙腈本身就是QuEChERS方法的提取溶剂，使用其作为样品定容溶剂直接上机，可省去前处理的吹干和溶剂置换的步骤，因而常在检测方法中被推荐使用。但在反相色谱系统中，样品的溶剂乙腈洗脱强度高于作为流动相的甲醇和乙腈的水溶液，因此样品在洗脱过程中会溶解在洗脱能力较弱的流动相中，这样就会造成色谱峰的展宽或分叉，引起柱效降低等一系列问题，进而导致分析方法准确性和精密度下降。

而乙腈+水(体积比1∶1)和甲醇+水(体积比1∶1)作为定容溶剂时，能很好地降低极性化合物，如灭蝇胺、甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧乐果的溶剂效应，减少峰的展宽，提高色谱峰的对称性，因而也常用于各类检测方法[16]。

高通量检测本身由于其能实现上百种农药的同时检测，因此常被视为农药残留检测的发展方向，因此在参照相关标准检测时，上百种农药配制形成的标准溶液常被用于此[17-20]。

参照日常检测过程对上述样品分别进行上机检测，间隔11 h对3种溶剂中98种农药峰面积进行统计，考察溶剂在多农药检测中的作用。

其中每个时间点进样2次，取平均值，某时间段的稳定性计算如公式(1)所示：

某时间段的稳定性/%

(1)

3种溶剂中98种农药11 h的稳定性如图1所示。

图1 三种溶剂中农药标准物质稳定性比较(间隔11 h)

由图1的结果可知，甲醇+水(体积比1∶1)中这98种农药的稳定性最好，在11 h内，除了四螨嗪、氟苯脲、杀扑磷和异菌脲以外，其他所有农药前后2次峰面积的比值都在10%以内。4种不稳定的农药中，呈现峰面积降低和上升2种趋势，其中四螨嗪和杀扑磷分别降解60.8%和10.2%，异菌脲和氟苯脲分别上升12.6%和21.2%。

乙腈+水(体积比1∶1)中这98种农药的稳定性次之，在11 h内，农药前后2次峰面积的比值大于10%的有四螨嗪、杀扑磷、阿维菌素、杀螟硫磷、特丁硫磷和氟苯脲。其中，四螨嗪和杀扑磷分别降解29.1%和16.7%，阿维菌素、杀螟硫磷、特丁硫磷和氟苯脲分别上升10.5%、16.0%、38.2%和82.7%。

乙腈中这98种农药的稳定性最差，在11 h内，农药前后2次峰面积的比值大于10%的包括氧乐果、杀螟硫磷、乙霉威、螺螨酯和吡虫啉等49种。其中氧乐果、杀螟硫磷、甲基硫菌灵、醚菊酯、伏杀硫磷、甲拌磷亚砜、霜霉威、甲胺磷、氟虫腈、甲拌磷、氟虫腈亚砜、四螨嗪、氟酰脲、乙酰甲胺磷、氟苯脲、氟虫腈砜、灭蝇胺、噻嗪酮和甲拌磷砜分别降解12.2%、12.7%、12.8%、12.8%、13.4%、13.7%、14.6%、20.4%、22.6%、26.4%、27.0%、29.1%、29.3%、33.1%、38.2%、46.6%、47.1%、65.8%和76.1%，乙霉威、螺螨酯、吡虫啉、氟啶脲、甲基硫环磷、特丁硫磷亚砜、喹硫磷、丙森锌、噻螨酮、噻菌灵、氟甲腈、二嗪磷、灭线磷、噻虫胺、辛硫磷、敌百虫、茚虫威、烯酰吗啉、氟虫脲、杀虫脒、噻虫啉、多菌灵、唑螨酯、霜脲氰、多杀菌素、马拉硫磷、阿维菌素、蝇毒磷、特丁硫磷、异菌脲分别上升10.2%、10.5%、10.5%、10.6%、10.6%、10.6%、10.9%、11.2%、11.5%、12.0%、12.6%、13.0%、13.1%、13.3%、13.5%、14.3%、14.4%、15.2%、15.3%、15.9%、18.3%、20.0%、20.1%、20.9%、24.8%、27.7%、31.4%、34.8%、54.4%和58.3%。

2.2 两种基质中3种溶剂对98种农药稳定性的影响

参照日常检测过程对上述样品分别进行上机检测，间隔3 h对韭菜和橙子中3种溶剂中98种农药峰面积进行统计。

各溶剂中某时间段的基质标样稳定性计算公式如公式1所示。

韭菜和橙子基质中，乙腈、乙腈+水(体积比1∶1)和甲醇+水(体积比1∶1)中98种农药3 h的稳定性如图2和图3所示。

图2 韭菜基质中3种溶剂的98种农药稳定性比较(间隔3 h)

图3 橙子基质中3种溶剂的98种农药稳定性比较(间隔3 h)

韭菜基质中3种溶剂中绝大部分3 h内农药稳定性偏差都在10%以内，稳定性较差的农药分别如下：甲醇+水(体积比1∶1)中杀螟硫磷和四螨嗪分别降解10.3%和19.8%。乙腈+水(体积比1∶1)中四螨嗪降解18.4%，杀螟硫磷、特丁硫磷和氟苯脲分别上升19.3%、18.5%和58.9%。乙腈中阿维菌素、氟虫腈和四螨嗪分别降解10.5%、13.3%和17.3%，氟苯脲和杀螟硫磷分别上升31.3%和32.5%。

橙子基质中3种溶剂中绝大部分3 h内农药稳定性偏差都在10%以内，稳定性较差的农药分别如下：甲醇+水(体积比1∶1)中杀螟硫磷降解27.0%，氟虫腈和氟虫腈砜分别上升15.8%和13.6%。乙腈中杀扑磷和四螨嗪分别降解11.5%和20.3%，异菌脲和阿维菌素分别上升12.5%和15.4%。

3 结 论

本文从溶剂入手，考察不同溶剂配制混合标准物质、2种农作物基质中不同溶剂配制标准物质中多种农药峰面积的稳定性。

标准物质3种常用的溶剂稳定性实验结果表明，甲醇+水(体积比1∶1)作为溶剂在样品定容时稳定性更佳，在11 h内能使绝大多数农药峰面积变化保证在10%以内，保证定量结果的相对可靠。乙腈本身就是QuEChERS方法的提取溶剂，而其作为上机溶剂可省去前处理的吹干和溶剂置换的步骤，但实验结果表明，乙腈作为溶剂配制的标准溶液，检测结果稳定性最差，在检测过程中应注意观察其稳定性。

标准物质在不同溶剂中不稳定的原因较为复杂，标准物质的物理性质、溶剂pH等性质等都有可能影响其稳定性，本文未对其原理进行研究。

2种基质(韭菜和橙子)标准物质稳定性结果表明，检测时间和基质对农药的稳定性也有作用，与韭菜基质相比，橙子基质对农药稳定性的帮助更大。

从标准物质稳定性出发，为保证检测数据的准确性，建议检测时应结合实际注意检测时长和样品溶剂，并使用基质标样对样品进行分类检测，以提高检测结果的准确度。