李基旭 赵文敬 韩学吉*

(1.延边朝鲜族自治州疾病预防控制中心，吉林延吉 133001；2.延边大学附属医院，吉林延吉 133001)

登革热是一种以急性发热为主要症状的蚊媒传染病，该病广泛流行于东南亚、中南美洲和非洲100多个国家和地区(Bhattetal., 2013)，是一个非常严重的公共卫生问题。登革病毒(Dengue virus, DV)分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型血清型(Srikiatkhachornetal., 2011)。我国把登革热列为乙类法定传染病报告和管理。近年来，随着出国务工人员的增多，吉林省延边朝鲜族自治州(延边州)时常发生输入性登革热病例，并且延边州又地处中国、朝鲜、俄罗斯三国交界，出入境口岸较多，给登革热疫情防控带来较大压力。之前，延边州一直只采用临床诊断病例标准对登革热进行诊断，该标准在控制输入性疫情方面存在较多局限性，无法对病毒分型，也无法进行病毒溯源分析。为了探索更为准确的登革热诊断方法，并监控病毒来源，我们开展了此次研究，现把结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例来源

刘某，男，48岁，吉林省延边州汪清县人，2019年9月5日到柬埔寨务工，2019年9月22日回国就医。

1.2 主要仪器与试剂

实时荧光PCR扩增仪(ABI7500，美国)、PCR扩增仪(ABI9700，美国)、组织核酸提取试剂盒(中国江苏硕世生物科技公司)、登革病毒通用型核酸检测试剂盒(中国江苏硕世生物科技公司)、Accu Power one step RT-PCR Pre-Mix(BIONEER，韩国)。引物由中国上海生工生物工程公司合成。

1.3 登革病毒荧光定量RT-qPCR检测

登革病毒RNA提取和检测均按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 登革病毒基因片段扩增

按照《全国登革热监测方案(试行)》(中国疾病预防控制中心，2005)指定的引物序列扩增登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型目标片段，详见表1。扩增体系为上下游引物(浓度：10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，配制20 μL体系。反应条件为42 ℃ 60 min，1个循环；94 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 3 min，1个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 登革病毒型特异性引物

1.5 基因测序和遗传进化树分析

扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并使用DNAStar软件进行校正，得到的序列与GenBank数据库中登革病毒序列进行一致性分析，并用Mega5.05软件进行系统进化分析。

2 结果

2.1 临床诊断

经流行病学调查，该患者在柬埔寨务工期间，在当地工棚居住。2019年9月20日开始突然出现发热、畏寒等症状，9月22日症状严重，出现头痛、眼眶痛、关节痛等症状，遂回国就医。该患者在发病前 15 d内有蚊虫叮咬史，并就医前未使用过任何药物。查体：后背有明显的皮疹和皮下出血点。入院血常规检测：白细胞为2.7× 109/L；血小板为35×109/L；尿蛋白+；单核细胞百分比为12%。按照《全国登革热监测方案(试行)》诊断标准(中国疾病预防控制中心，2005)，可以诊断为登革热临床诊断病例。2019年9 月22日采集患者全血1份。

2.2 登革病毒检测结果

经实时荧光RT-qPCR检测，该患者血样显示为登革病毒阳性。经四种型别登革病毒RT-PCR扩增，在登革病毒Ⅰ型490 bp 处出现扩增条带，未见有其他型特异性产物，详见图1。

图1 吉林延边州1例输入性登革热病例登革病毒RT-PCR扩增结果

2.3 基因测序和遗传进化树分析

将所得登革病毒Ⅰ型扩增产物进行测序，得到了长度为428 bp 的基因序列(登录号：MN611473)。把此基因序列和GenBank数据库中默认基因序列进行比对，发现该基因序列与2017年越南登革热疫情暴发中发现的登革病毒Ⅰ型基因序列(登录号：LC428079)同源性最高，达到了99%(424/428)；与同源性较高的部分登革病毒Ⅰ型基因序列进行进化分析发现，其基因序列与越南病毒株101-TN-056(LC428079)和111-HD-004(LC428054)基因序列处于一个分枝，详见图2。

图2 吉林延边州1例输入性登革热病例登革病毒基因序列系统进化分析

3 讨论

目前，随着全球气候的变化，登革热疫情呈现扩大趋势，过去50年全球疫情上升30倍(刘美辰等，2014)。对于中国登革热疫情，专家认为“我国登革热疫情是由输入病例引起本地病例的暴发及流行”(刘起勇，2020)。延边州位于中国、朝鲜、俄罗斯三国交界，边境线较长。延边州虽然没有本地登革热病例报告，但时常发生本地赴东南亚务工、旅游、从商人员在当地罹患登革热后回国的现象，导致延边州时而出现输入性登革热散发疫情。据国内学者调查，延边州有多种伊蚊分布(刘国平等，2012)，而且临近国家蚊虫分布和登革热疫情始终不明，不能排除登革热疫情通过媒介伊蚊跨境传播的可能性。在蚊虫繁殖高峰季节，这些因素很可能促发输入性登革热疫情在本地蔓延。因此在吉林省延边州要做好登革热病例的早发现、早报告、早诊断、早隔离、早治疗，尤其在病例诊断上要采取更加有效、更加精确的方法。据文献报道，在登革热的诊断中，发病早期的病例应采用比抗体检测更为灵敏的检测方法(阳帆等，2012)。目前，分子生物学技术广泛应用于登革热实验室诊断,使诊断更为精准(王宇平等，2010)。为了精准防控输入性登革热疫情，提升预警能力，我们采用病毒基因扩增和序列分析方法，首次在本地确诊了1例输入性登革热病例，并判定了病毒型别和输入来源，为流行病学调查和临床诊断提供了坚实的依据。结果显示，该病例在柬埔寨务工期间有明确的蚊虫叮咬史，其临床症状和辅助检查结果符合临床诊断标准，可以确定为临床诊断病例。经登革病毒实时荧光RT-qPCR检测，结果为阳性，进一步确认为实验室确诊病例。经基因序列扩增和同源性分析，确认该输入性登革热病例为登革病毒Ⅰ型感染，病毒来源于2017年越南登革热疫情暴发。