叶健文，逯耀锋，黄悟哲，吴赴清，陈国强*

（1.清华大学生命科学院，北京100084；2.中国载人航天工程办公室，北京100034）

1 引言

开展长周期、远距离、多乘员的载人深空探测和地外星球驻留是未来载人航天发展的必然方向。但由于空间飞行中以及星球表面均缺乏人类生存必需的物质资源供给，因此需要探索如何利用生物技术改造生物体，使其可在空间环境下实现废弃物转化［1-2］、星球资源原位利用、必需物质生产、星球环境地球化［3］等任务。

近年来，随着合成生物学等技术的迅速发展，研究人员可将微生物作为细胞工厂，通过工程化手段对其进行改造［4-5］，改造后的微生物可高效转化利用多种物质或可生产出具有不同性质的生物材料［6-7］。因此，研究在空间环境下利用改造后的微生物进行无灭菌开放的高密度培养，如工程改造的嗜盐单胞菌TD在三段式补料开放发酵中干重超80 g/L［8］，从而转化载人航天任务中不断产生的生活废弃物［9-10］，或利用地外星球的特有资源，实现材料等物质资源的生物合成，例如在太空合成生物基可降解材料、生物质能源等，已经成为具有战略意义的研究方向之一。但是，由于载人航天飞行任务的特殊性，受限于上行资源条件约束，开展此类研究的实验装置必须实现轻量化；考虑到飞行乘组操作要求，此类实验设计还必须简便、易操作；鉴于空间环境中可利用资源的匮乏，在工艺流程中必须考虑资源更加高效地循环利用。现阶段，由于存在设备组装装载复杂、发酵生产工艺可操作难度大、资源循环利用困难等问题，限制了利用高速生长的微生物转化月球上废弃物为生物塑料的可行性尝试。

综上，本文设计一种轻量化、便捷组装的发酵罐，并基于下一代工业生物技术平台［11-12］提出利用该发酵罐实现无灭菌、可循环发酵的工艺设计。通过利用嗜盐单胞菌在轻量化发酵罐内进行无灭菌、可循环的发酵实验，旨在解决现有发酵设施质量大、操作复杂、资源利用率低的问题，从而生产可生物降解的聚羟基脂肪酸酯材料，为解决载人航天任务中可利用物质资源匮乏问题提供新的研究思路。

2 发酵罐的优化设计

嗜盐单胞菌Halon onas bluephagenesis TD01［13］（以下简称TD）由于对生长环境具有较好的生长鲁棒性以及对不同极端环境具有较强的抗逆性和耐受性，已被用于开发下一代工业生物技术底盘菌［14］。以TD为研究对象，可采用无灭菌的连续开放发酵工艺，从而降低对能源和水资源的消耗，实现多种聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）、蛋白质和5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic Acid，ALA）等化学品的低成本生产［15-16］。

传统的实验室小试规模发酵罐主要由4部分组成：主控制器、发酵罐体、空气压缩机和冷水机（图1），其中主控制器和发酵罐体是核心组成部分。主控制器负责发酵过程的温度、pH、溶氧、搅拌桨转速、补料等条件的反馈控制；空气压缩机和冷水机根据实际发酵需求进行配套使用；发酵罐体主要给微生物生长提供稳定均一的传质和传热条件。小试规模的发酵罐体一般由不锈钢支架和玻璃罐体组成，易碎且质量较大。传统的发酵工艺需要保证微生物无杂菌的生长环境，通常需要经高温高压蒸汽灭菌后使用，操作过程较为复杂，且需要额外配备蒸汽灭菌锅。受玻璃罐体易碎、不锈钢罐体质量大等不利因素制约，载人航天飞行任务中无法利用传统发酵罐和发酵工艺进行材料生产。

可以选择塑料材料作为发酵罐体的制作材料，用于开展后续在轨实验的地面验证工作。在众多塑料选材中，亚克力塑料以其耐腐蚀、高透明度、高强度和易加工等特性被应用在很多领域，如水族馆、观光幕墙等。本文采用亚克力塑料制作发酵罐体、上下封头搅拌系统以及各封头接口和导管等配件。发酵罐的上封头和罐体之间用定位销加螺纹接口进行固定，其他接口固定方式均采用螺纹结构，以方便快速拆装。初步设计的小试规模发酵罐体总体积为10 L，制造雏形如图2所示。发酵罐控制器可以维持原有设计，包括补料、温控、pH控制、进气系统等［17-18］，该设计相对传统不锈钢发酵罐或玻璃发酵罐减重60%以上，拆卸或组装更简易，且在后续优化过程中可以针对工艺进行功能模块的调整，以减少主控制器的体积，降低组装复杂性。

由于嗜盐菌TD可以允许无灭菌开放发酵，因此发酵准备前培养基一级发酵罐体不需要经过复杂的高温蒸汽灭菌操作。此外，发酵过程中没有对接种时的无菌操作和空压机供气的过滤除菌有严格要求。

图2 10 L塑料发酵罐Fig.2 10 L plastic bioreactor

3 发酵工艺优化

下一代工业生物技术是基于嗜盐单胞菌开发的，以海水作为发酵用水的无灭菌开放工业发酵技术，集合了高效的基因改造技术和嗜盐微生物的底盘优势。该工艺以在空间环境下利用微生物发酵合成生物基可降解材料，并以高效循环利用发酵用水为目的，拟通过开发并优化工艺设计，以提高微生物发酵的可行性、操作便捷性以及微生物合成目标产物的发酵产率。

基于嗜盐菌TD及其衍生的基因工程改造菌株，目前已开发了较稳定小试规模发酵工艺以及中试规模放大发酵的工艺，并利用葡萄糖或γ-丁内酯作为碳源生产聚-3-羟基丁酸酯（P3HB）和聚-3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯（P3HB4HB）共聚物，其发酵总生物量均能达到80 g/L，且PHA质量百分比基本实现60%～70%［8］，如表1所示。虽然目前该工艺已经实现了产业化的中试放大验证，如经济性（成本计算）、稳定性（批次稳定性）和可放大规模（千吨或万吨级）等相关验证，但是发酵最终生物量和PHA产量仍有可突破空间。因此，在进行塑料发酵罐设计的同时，对该发酵工艺进行了进一步优化。

在细菌的高密度培养过程中，主要分为3个时间期，依次为适应期、对数生长期和平台期。一般而言，对数生长期是细菌进入指数分裂的快速生长期，需要供应相应的溶氧及营养物，以适应该时期细菌生长所需的物质来源。在前期开发的三段式补料发酵工艺中（表2）［8］，补料I作为对数生长期主要的氮供应来源，补料II和补料III开始限制氮源供应，同时提供稳定的碳源用以合成PHA，从而实现细菌生长和PHA积累的解偶联。

表1 用于塑料发酵罐高密度发酵的菌种［8］Table 1 Strains for high cell density cultivation in p lastic bioreactor［8］

表2 嗜盐菌三段式补料发酵培养组份［8］Table 2 Formula of three-phase feeding solution for Halomonas cultivation［8］

然而细菌的对数生长随着菌体密度的增大是一个动态变化过程，尤其是在菌体密度相对较低的对数前期，其生长速度较快，接近指数生长趋势，对氮源的消耗量较大；而在对数期中后期，因菌体密度增大，溶氧供应受限及群体效应影响，其生长速度开始逐渐减缓，其对氮源的利用逐渐减弱。因此，本文将补料I拆分成补料I和补料I'来分配不同的碳源和氮源比例，以适应2种不同的生长需求，其中补料I中的氮源比重较多，补料I'中的氮源比重较小。同时，在这2段补料中引入玉米浆粉来部分替代尿素作为氮源，因为玉米浆粉中除了含有大量有机氮源利于生长外，还有较丰富的生长因子可以促进细菌的生长。补料配方更改如表3所示。

表3 嗜盐菌四段式补料发酵培养组份Table 3 Formula of four-phase feeding solution for Halomonas cultivation in this study

基于以上发酵补料的优化设计，本文首先用TD40菌株在常规小试规模发酵罐中对以上四段式发酵补料策略进行验证分析。结果表明：四段补料发酵的干重对比三段式补料发酵工艺［19］在总生物量上提高了12%，达到91 g/L，而PHA含量超75%，聚合物中4HB的摩尔比例均超10%，各项参数及性能达到该材料的下游加工需求，具体如图3所示。因此，本文的发酵工艺优化策略得以验证，并值得在塑料罐中进行复制实验验证。

图3 基于TD40菌株的四段补料发酵工艺在常规发酵罐的优化结果Fig.3 Fermentation study of TD40 strain based on four-phase feeding solution in traditional bioreactor

在完成发酵工艺优化后，将四段补料的发酵工艺复制到新设计制造的塑料发酵罐中进行实验。塑料发酵罐中仍保持开放无灭菌的发酵方式，经过48 h的发酵，总生物量达到86 g/L，PHA含量达到71%，4HB比例也能达到10%的摩尔比标准，如图4所示。新设计的塑料发酵罐不仅可以实现同等效果的嗜盐菌TD发酵，而且经过批次的发酵实验发现该发酵罐并未出现变形、开裂等力学性能退变。所以，以塑料作为发酵罐的制造材料可以达到预期的轻量化、组装简易等设计要求。

图4 基于TD40菌株的四段补料发酵工艺在塑料发酵罐中的发酵结果Fig.4 Ferm entation study of TD40 strain based on four-phase feeding solution in p lastic bioreactor

基于TD40菌株验证了四段补料发酵工艺以及塑料发酵罐的设计后，针对不同的嗜盐菌工程改造菌株进行横向验证实验。分别针对P3HB的高产菌TDU［20］和P3HB4HB的高产菌TDH4［21］在塑料发酵罐中进行发酵实验，结果如图5所示。在52 h的发酵实验中，TDH4菌株的发酵总生物量高达100 g/L，PHA含量达到86%，4HB摩尔比例达到8.5%。而TDU菌株的发酵总生物量也高达83.5 g/L，PHA含量达到79.3%。实验证明四段式发酵工艺和塑料发酵罐对不同的工程改造菌均有较好的适用性。

图5 其他工程菌对于四段发酵工艺的发酵结果Fig.5 Fermentation study of other engineered Halomonas based on four-phase feeding solution

根据Ling等［22］的研究，乙酸的添加有利于PHA在嗜盐菌TD中的积累，本文在此基础上在补料中添加乙酸钠对发酵工艺进行进一步的优化。基于乙酸钠添加（添加6 g/L乙酸钠）优化策略及配方见表3。优化后的工艺在塑料发酵罐测试中，经过52 h的发酵，TDH4菌株的发酵总生物量高达107.8 g/L，PHA含量达到74.4%，4HB摩尔比例达到8.3%；而TDU菌株的发酵总生物量也高达102.6 g/L，PHA含量达到69.3%。这是目前嗜盐菌TD在小试规模发酵罐中能达到的最高发酵水平［8］。因此，乙酸钠对于细菌的发酵生长起到正向的作用。

图6 乙酸钠添加对于四段发酵工艺的优化结果Fig.6 Sodium acetate addition for fermentation optim ization based on four-phase feeding solution

4 废水发酵优化循环测试

开展了发酵废水循环利用的测试，拟将一次发酵后的发酵液进行离心分离，将分离后的发酵液上清经简单热处理后重新返回到发酵罐中进行二次循环发酵，以实现发酵液最大限度的重复利用，具体流程如图7所示。在发酵废水循环测试中，仍选用已经实现工业化中试生产的TD40菌株进行验证分析，发酵工艺是基于优化后的四段补料发酵工艺。

图7 基于塑料发酵罐的发酵液循环利用流程Fig.7 Fermented supernatant recycling design based on plastic bioreactor system

首先将首次发酵后的发酵液上清进行收集，经热处理后返回到塑料发酵罐中，补充固定的发酵底料和菌种种子液后进行一次循环发酵，发酵结果如图8所示。经48 h发酵后，发酵总生物量达到83 g/L，PHA含量达到68%，4HB摩尔比例达到9.7%。

图8 以TD40菌种为基础基于塑料罐优化工艺的一次发酵Fig.8 First round fermentation study of TD 40 strain by using optim ized plastic bioreactor technique

经同样的发酵液分离回收流程，针对发酵液上清继续进行二次循环发酵，发酵结果如图9所示。经48 h发酵后，其发酵总生物量降低至76 g/L，PHA含量降低到48%，4HB摩尔比例3.6%，虽然发酵结果整体出现较明显的降低，但仍能维持相对较高的PHA产量。另外，发酵前期的4HB摩尔比例波动的原因可能在于发酵液上清重复使用，积累了较多前批次未消耗完的γ-丁内酯，导致前期4HB摩尔比波动较大，同时也可能对细菌生长带来一定的抑制作用。因此，未来可仅利用葡萄糖生产P3HB或者P34HB的工程菌株，细菌的发酵液上清中就消除了γ-丁内酯残留的影响，减少循环中对菌株生长的抑制，从而增加废液循环次数。

图9 以TD40菌种为基础基于图7发酵废水循环利用的二次发酵Fig.9 Second round fermentation study of TD 40 strain by using fermented supernatant recycling

5 结论

1）轻型发酵罐相较于传统发酵罐减重60%以上，拆卸或组装更简易，试验证明其在嗜盐菌开放无灭菌发酵工艺的适用性，在批次重复的耐久性测试和稳定性上均无退化现象；

2）四段式补料的发酵工艺对嗜盐菌发酵生产PHA具有促进作用，添加乙酸钠能提高嗜盐菌发酵的总生物量，从而获得更高的PHA产量；

3）发酵废水经2次循环利用后仍能够维持较高的PHA产量，证明优化后的工艺可实现发酵用水的循环利用。

综上，基于下一代工业生物技术平台的轻型发酵罐设备已完成部分地面验证，获取的数据满足实验设计要求，为后续进一步开展空间飞行验证奠定了基础，其实验结果可为未来载人深空探测、建立月球基地乃至实现地外星球长期驻留的物资循环利用提供新的思路。

致谢：本研究得到了迪必尔生物工程（上海）有限公司的支持，谨致谢意。