姬涛，单玉刚，李怀平，马宏伟，田小雪通讯作者）

（金诃藏药（山东）健康产业有限公司，山东 济南 250101）

0 引言

斑马鱼(Danio rerio)是一种简单的生物实验动物,具有和哺乳动物相似的生物结构和生理功能。几乎透明的胚胎、胚胎的体外发育以及与人类高达87%的基因相似性，使得斑马鱼被广泛用于药学领域的研究。模式动物斑马鱼在生态毒理学、发育遗传学等研究领域已得到广泛应用。近年来，斑马鱼模型已拓展延伸至人类疾病动物模型、药物代谢及药物筛选研发等多个方面。国内外文献报道[1-5]，斑马鱼模型在现代药学研究中关于疾病动物模型、药物活性筛选及代谢研究方向的研究取得了很大进展。本实验首次将斑马鱼模型用于评价抗雾霾作用，为其拓展应用提供了参考。

1 资料与方法

1.1 实验目的。观察评价金诃含片对斑马鱼肠蠕动的促进作用，为金诃含片在抗PM2.5领域开发提供参考。

1.2 实验动物。野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后5天，共210尾用于金诃含片对肠蠕动的促进作用实验，每实验组为30尾斑马鱼。以上斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480-510 μS/cm；pH为6.9-7.2；硬度为53.7-71.6 mg/L CaCO3），实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

1.3 实验药物。金诃含片，棕色粉末，于2017年09月11日收样，由金诃藏药（山东）健康科技有限公司提供，常温阴凉避光保存。临用前用超纯水配制成浓度为50 mg/mL的母液，-20℃保存。临用时用养鱼水按需稀释。金嗓子喉片，市售成品，棕褐色片剂，批号17031301，于2017年09月11日收样，由山东金诃药物研究开发有限公司提供，常温阴凉避光保存。临用前用超纯水配制成浓度为200 mg/mL的母液，-20℃保存。临用时用养鱼水按需稀释。

1.4 仪器与试剂。解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；6孔板（Fisher Scientific，China）；精密电子天平（CP214，奥豪斯）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon，Japan）；尼罗红（Sigma,China）；甲基纤维素（Sigma，China）。

1.5 浓度组别。实验1组：模型对照组；实验2组：金诃含片56 µg/mL；实验3组：金诃含片167 µg/mL；实验4组：金诃含片500 µg/mL；实验5组：金嗓子喉片222µg/mL；实验6组：金嗓子喉片667 µg/mL；实验7组：金嗓子喉片2000 µg/mL。

1.6 浓度确定依据。根据金诃含片（对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为500 µg/mL）和金嗓子喉片（对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）大于2000 µg/mL）对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC），确定金诃含片对肠蠕动的促进作用评价浓度设计为56 µg/mL（1/9 MTC）、167 µg/mL（1/3 MTC）和500 µg/mL（MTC）；金嗓子喉片对肠蠕动的促进作用评价浓度设计为222 µg/mL（1/9 MTC）、667 µg/mL（1/3 MTC）和2000 µg/mL（MTC）。

1.7 模型制作。用养鱼用水将尼罗红配制成10 ng/mL溶液，把5 dpf AB品系斑马鱼放入其中16 h使斑马鱼将尼罗红吞入肠道，建立斑马鱼肠蠕动评价模型。

1.8 实验方法。随机选取210尾受精后5天（5 dpf）野生型AB品系斑马鱼，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，水溶给予尼罗红16 h建立斑马鱼肠蠕动评价模型。模型斑马鱼分别水溶给予金诃含片56、167、500 µg/mL浓度和金嗓子喉片222、667、2000 µg/mL浓度，同时设置模型对照组，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，每孔容量为3 mL。金诃含片和金嗓子喉片处理24 h后，每组随机取10尾斑马鱼在荧光显微镜下观察斑马鱼肠腔中荧光染料信号强度、拍照并保存图片，用尼康NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肠腔荧光染料信号强度（S）进行结果分析，评价金诃含片促进肠道蠕动作用。肠蠕动促进率计算公式如下：

用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，P＜0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

2 实验结果

金诃含片在浓度为56、167和500 μg/mL时，斑马鱼肠腔荧光强度分别为562579、531775和343828像素，其肠蠕动促进率分别为21.4%、25.7%和52.0%，与模型对照组（715433像素）比较，56 μg/mL浓度组P＞0.05，167 μg/mL浓度组P＜0.05，500 μg/mL浓度组P＜0.001，提示金诃含片在167和500 μg/mL浓度下对斑马鱼肠蠕动有促进作用，详情见表1。

表1 金诃含片各实验组斑马鱼肠蠕动促进率

金嗓子喉片在浓度为222、667和2000 μg/mL时，斑马鱼肠腔荧光强度分别为332834、323298和99571像素，其肠蠕动促进率分别为53.5%、54.8%和86.1%，与模型对照组（715433像素）比较，222、667和2000 μg/mL浓度组P＜0.001，提示金嗓子喉片对斑马鱼肠蠕动有明显的促进作用，详情见表2。

表2 金嗓子喉片各实验组斑马鱼肠蠕动促进率

3 实验结论

在本实验浓度条件下，于2017年09月11日提供的金诃含片和金嗓子喉片具有促进斑马鱼肠蠕动的作用。根据上述实验结果：在本实验浓度条件下，金诃含片对斑马鱼的最大耐受浓度为500 µg/mL，金嗓子喉片对斑马鱼的最大耐受浓度大于2000 µg/mL。金诃含片对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能有明显的促进作用，对斑马鱼肠蠕动也有促进作用，对斑马鱼分泌纳米活性炭进入肠道有促进趋势。金嗓子喉片对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能有明显的促进作用，对斑马鱼肠蠕动也有促进作用，对斑马鱼分泌纳米活性炭进入肠道有促进趋势。