卢森华 刘佳明 张凤懿

摘要：为优化当归藤（Embelia parviflora Wall）中总黄酮提取工艺，在单因素试验的基础上，以提取溶剂体积分数、料液比和提取时间为影响因素，采用L9（34）正交试验优化当归藤中总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，提取溶剂体积分数、料液比和提取时间对当归藤中总黄酮提取率均有显著影响，优化后的当归藤中总黄酮的最佳提取工艺为50%乙醇溶液料，液比1∶200，提取时间120 min，芦丁质量浓度在9.16～54.96 μg/mL（r=0.999 8）范围内线性关系良好，平均回收率为97.6%（n=6），RSD为2.2%。

关键词：当归藤（Embelia parviflora Wall）;总黄酮;含量;提取工艺

中图分类号：TQ461         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）10-0123-004

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.029            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： To establish the extraction technology and content determination method of total flavonoids in Embelia parviflora Wall. On the basis of single factor experiment， the optimum extraction technology of total flavonoids from Embelia parviflora Wall was optimized by L9（34）orthogonal test， and the content of total flavonoids in Embelia parviflora Wall was determined.   Results showed that the extraction solvent concentration， the ratio of material to liquid， and the extraction time all had significant effects on the extraction rate of total flavonoids from Embelia parviflora Wall. The optimum extraction technology of total flavonoids from Embelia parviflora Wall was material-liquid ratio of 1：200， and reflux extraction at 100 ℃ in water bath for 120 min. The linear relationship of rutin concentration was good in the range of 9.16～54.96 μg/mL（r=0.999 8）. The average recovery was 97.6%（n=6）， and RSD was 2.2%.

Key words： Embelia parviflora Wall; total flavonoids; content; extracting techonology

当归藤为紫金牛科植物小花酸藤子（Embelia parviflora Wall）的根与老茎，别名土当归、筛其蔃等，分布于广西、云南等地，全年均可采[1]。其味苦、涩，性温，具有活血、补血、益精壮阳、强腰膝的功效，常用于治疗血虚诸症、跌打骨折、腰腿酸痛等病症[2，3]。当归藤的化学成分复杂，目前从当归藤中分离得到的化合物包括黄酮类、萜类、甾体类等[4-6]。现代药理研究表明，当归藤具有抗炎、镇痛、抗凝血等药理作用[7，8]。当归藤中黄酮类成分含量较多，目前已有学者对当归藤中总黄酮的提取工艺[9]及其含量测定方法[10]进行了初步考察，但总黄酮的提取工艺有待进一步优化，测定方法中对照品的选择及显色方法方面都存在欠缺。因此，本试验采用正交试验优化当归藤中总黄酮的最佳提取工艺， 并测定其含量，以期为当归藤资源深度开发提供科学依据。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1  药材与试剂  试验所用当归藤样品经广西中医药大学陈勇教授鉴定为紫金牛科植物小花酸藤子的干燥根与老茎。芦丁标准品（批号0080-9705，中国药品生物制品检定所）;甲醇、无水乙醇、硝酸铝[Al（NO3）3]、亚硝酸钠（NaNO2）、氢氧化钠（NaOH）均为分析纯，广东光华科技股份有限公司。

1.1.2 仪器  紫外-可见分光光度计（8453型，美国Agilent公司）;超级恒温水浴锅（501型，金坛市医疗仪器厂）;电子天平（BP211D型，德国Sartorius公司）;超声清洗仪（B35005-MT型，上海必能信公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准品溶液的制备  精密称取芦丁标准品（120 ℃干燥至恒重）5.72 mg，置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液适量使溶解，再用50%乙醇溶液定容，搖匀，即得浓度为0.229 mg/mL的标准品溶液。

1.2.2 检测波长的确定  取芦丁标准品溶液及样品溶液各2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，首先加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置5 min，然后加10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置5 min，再加4% NaOH溶液10 mL，用50%乙醇溶液定容，摇匀，静置10 min，以50%乙醇溶液为参比。利用UV-Vis法在200～800 nm扫描，结果在508 nm处芦丁有最大吸收，故确定508 nm为测定波长（图1、图2）。

1.2.3  标准曲线的建立  精密量取芦丁标准品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，经过5% NaNO2溶液-10% Al（NO3）3溶液-4% NaOH溶液显色后，利用UV-Vis法在508 nm处测定标准品溶液吸光度，结果见图3。以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=12.26x+0.007 7，R2=0.999 8。

1.2.4  样品溶液的制备及总黄酮含量的测定  精密称定当归藤样品0.5 g置于250 mL磨口锥形瓶中，按单因素试验中不同的提取条件进行提取。精密量取样品溶液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，经过5% NaNO2溶液-10% Al（NO3）3溶液-4% NaOH溶液显色后，利用UV-Vis法在508 nm处测定样品溶液的吸光度，并计算当归藤中总黄酮的含量。

1.2.5  正交试验  采用L9（34）正交设计表进行试验设计，在单因素试验基础上，进一步考察提取溶剂体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C）对当归藤中总黄酮提取率的影响，以确定当归藤中总黄酮的最佳提取工艺。因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1 提取方法考察  取当归藤样品3份（每份0.5 g），置于250 mL磨口锥形瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL，分别采用静置、水浴加热回流、超声3种方法提取1.0 h后过滤，取续滤液1.0 mL，分别置25 mL量瓶中，测定结果如图4所示。由图4可以看出，使用水浴加热回流提取方法时当归藤中总黄酮的含量最高。

2.1.2  提取溶剂考察  取当归藤样品2份（每份0.5 g），置于250 mL磨口锥形瓶中，分别加入50%乙醇溶液和50%甲醇溶液各50 mL，水浴加热回流提取1.0 h后滤过，取续滤液1.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，测定结果如图5所示。由图5可以看出，使用50%乙醇溶液为提取溶剂时得到当归藤中总黄酮的含量较高。

2.1.3  提取次数考察  取50%乙醇溶液提取1次后的当归藤药渣，再加入50%乙醇溶液50 mL，水浴加热回流提取1.0 h后滤过，取续滤液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，测定结果如图6所示。由图6可以看出，提取1次后，当归藤中总黄酮含量下降较多，考虑到生产工艺对时间的要求和溶剂的损耗，提取次数以1次为宜。

2.1.4  提取溶剂体积分数考察  取当归藤样品4份（每份0.5 g），置于250 mL磨口锥形瓶中，分别加入30%、50%、70%、95%乙醇溶液各50 mL，水浴加热回流提取1.0 h后过滤，取续滤液1.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，测定结果如图7所示。由图7可以看出，使用50%乙醇溶液为溶剂体积分数时得到当归藤中总黄酮的含量最高。

2.1.5  提取时间考察  取当归藤樣品4份（每份0.5 g），置于250 mL磨口锥形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，分别水浴加热回流提取10、30、60、120 min后过滤，取续滤液1.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，测定结果如图8所示。由图8可以看出，提取时间为60 min时得到当归藤中总黄酮的含量最高。

2.1.6 料液比考察 取当归藤样品3份（每份0.5 g），置于250 mL磨口锥形瓶中，料液比分别为1∶50、 1∶100、1∶200，水浴加热回流提取1.0 h后过滤，取续滤液1.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，测定结果如图9所示。由图9可以看出，料液比为1∶100时得到当归藤中总黄酮的含量最高。

2.2  正交试验结果

从表2可知，影响当归藤中总黄酮提取率的主次因素为A>B>C，即提取溶剂体积分数>料液比>提取时间，3因素中A2>A3>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1。从方差分析结果（表3）可知，提取溶剂体积分数、提取液料比和提取时间均有显著性差异（P<0.05），确定当归藤中总黄酮最佳提取工艺为A2B3C3，即50%乙醇溶液，液料比为1∶200、100 ℃水浴加热回流提取120 min。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 精密度试验  精密吸取芦丁标准品溶液2.0 mL，连续测定6次。结果表明，芦丁标准品溶液吸光度平均值为0.58，RSD为0.04%，该方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验  精密称定同一批当归藤样品（百色金秀）6份，每份0.5 g，置于250 mL磨口锥形瓶中，测定吸光度并计算当归藤中总黄酮含量。结果表明，当归藤中总黄酮平均含量为11.77%，RSD为1.0%，该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验  取供试品溶液1份，在30 min内每隔5 min测定吸光度。结果表明，当归藤样品溶液的吸光度平均值为0.59，RSD为1.2%，该方法稳定性良好。

2.3.4 加样回收试验  精密称定已知含量（含量为11.77%）的当归藤样品（百色金秀）6份，每份0.25 g，置于250 mL磨口锥形瓶中，分别加入芦丁对照品29.43 mg，测定吸光度，并计算当归藤中总黄酮的回收率，结果见表4。由表4可以看出，当归藤中总黄酮的平均回收率为97.6%，RSD为2.2%。

2.4  样品测定

精密称定6个产地当归藤样品各0.5 g，置于250 mL磨口锥形瓶中，测定吸光度并计算当归藤中总黄酮含量结果见表5。、

3  讨论

目前，测定中药中总黄酮的含量较常用的方法是比色法（UV-Vis法），主要依据总黄酮成分特征性的结构具有特定的显色反应，利用适当的显色剂显色，在适当的波长下测定吸光度，从而实现对化学结构上具有共同特征的总黄酮成分定量[11，12]。本试验采用UV-Vis法测定当归藤中总黄酮含量，精密度、重复性、稳定性和回收率均达到定量分析的方法学考察的要求，且简便易行。

参考文献：

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