肖晓霞 陈畅 夏宝妹 陶伟伟

南京中医药大学1第一临床医学院，4基础医学院（南京210023）；2南京中医药大学第三附属医院（南京210001）；3南京特殊教育师范学院康复科学学院（南京210023）

产后抑郁症（postpartum depression，PPD）是分娩最常见和致残的并发症之一，其发病率在高收入国家为6.9%～12.9%，低中等收入国家达到20%以上［1］。约20%的患者出现自杀念头，其引起的产妇自杀是导致孕产妇死亡的主要原因［1-2］，给产妇、家庭及社会带来严重危害。因此，研究PPD 的发病机制以及药物防治具有重要的临床意义。

哺乳动物sirtuins（SIRT1-7）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖性脱酰酶，参与衰老、炎症、能量代谢、细胞分化、应激反应等多种细胞过程的调节［3-4］。sirtuins具有不同的亚细胞定位和酶活性。其中，沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）表现出NAD 依赖性脱乙酰酶活性，可使多种底物去乙酰化。研究［5-7］表明SIRT1 在抑郁症的发病中发挥重要作用，但其在PPD 的发病机制中鲜有研究。细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）—核糖体S6 蛋白激酶（ribosomal S6 kinase，RSK）—转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）信号通路是将细胞外刺激信号从细胞表面受体传导至细胞核的重要信号转导途径之一，其在神经系统相关性疾病中被广泛研究。研究［8］发现ERK信号参与了SIRT1 介导的神经保护作用，两者协同发挥神经保护作用。但在PPD 中ERK 信号是否参与了SIRT1 介导的抗抑郁作用，尚未见到相关报道。

氟西汀、丙咪嗪等传统抗抑郁药会导致患者出现头痛、恶心、口干等不良反应［9］，且治疗周期长、费用高，临床上患者治愈率往往不高。与西药治疗相比，中药具有整体调节、副作用小、价格低廉等优势，近年来已成为PPD 新药研发的热点。其中，越鞠甘麦大枣汤由“统治六郁”的越鞠丸合甘麦大枣汤划裁而来，在实践中疗效确凿［10］，但其相关基础研究较少。本实验在构建PPD 动物模型的基础上，以SIRT1-ERK1/2 信号通路为切入点，探讨在PPD 模型中是否存在该信号通路的异常，以及越鞠甘麦大枣汤能否通过该通路发挥抗抑郁作用，以期为PPD 的临床治疗提供新思路和研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物Balb/c 雌性小鼠40 只，6～8 周龄，体质量20～22 g，购买于青龙山动物中心，动物合格证：SCXK（苏）2016-0010。

1.2 药物及试剂实验药材购自南京中医药大学国医堂门诊。越鞠甘麦大枣汤组方：神曲100 g、香附100 g、栀子100 g、淮小麦250 g、苍术100 g、川芎100 g、大枣375 g、炙甘草125 g。上述药物加8 倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，收集药液，加6 倍量水2 次煎煮，合并两次药液，65 ℃旋蒸浓缩至药物终浓度为8.3 g/kg；艾司西酞普兰（美仑，批号：MB1290）；抗体：SIRT1（Affinity，货号：DF6033）、ERK（CST，货号：9102）、P-ERK（CST，货号：4376）、P90RSK（Affnity，货号：AF4777）、CREB（proteintech，货号：12208-1-AP）、GAPDH（proteintech，货号：60004-1-Ig）；蛋白Marker（良纬科技，货号：Y007）；ECL 发光液（Affinity，货号：KF001）。

1.3 主要仪器动物行为分析系统（Any-maze，USA）；蛋白电泳及转膜仪（Bio-Rad，USA）；凝胶成像及分析系统（Tannon-5200，上海天能）。

1.4 模型制备及越鞠甘麦大枣汤给药40 只雌性Balb/c 小鼠随机分为对照组、模型组、艾司西酞普兰组和越鞠甘麦大枣汤组，每组10 只。除对照组，应激母鼠每天给予束缚刺激6 h（11：00～17：00）联合每周2 次24 h 光照刺激。应激6 周后，对照组和应激小鼠均与正常雄性Balb/c 小鼠合笼交配。小鼠分娩3 周后，对照组和模型组按10 mL/（kg·d）剂量生理盐水灌胃，艾司西酞普兰组按20 mg/（kg·d）剂量腹腔注射，越鞠甘麦大枣汤组按8.3 g/（kg·d）剂量灌胃，给药2 周，进行糖水偏好和强迫游泳测试，以小鼠糖水偏好降低和强迫游泳不动时间增加为判断造模成功的主要依据。

1.5 指标检测

1.5.1 糖水偏好测试造模前，每只小鼠给予两瓶2% 蔗糖溶液适应3 d。测试前24 h，小鼠单笼饲养，禁食禁水，每只小鼠给予2%蔗糖溶液和纯水各1 瓶，1 h 后交换蔗糖溶液和纯水瓶的位置，记录小鼠2 h 内蔗糖溶液和纯水的消耗量。蔗糖消耗百分比计算公式为：蔗糖消耗%=［（蔗糖消耗量）/（蔗糖消耗量+纯水消耗量）］×100%。

1.5.2 强迫游泳测试将小鼠置于水深约为15 cm的圆柱体玻璃容器（直径18 cm，高25 cm）中，调整水温为24～26 ℃，每只小鼠共游泳6 min。Anymaze 软件记录小鼠活动，并分析最后4 min 的不动时间。

1.5.3 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达水平小鼠处死后在冰上取出海马组织，提取蛋白并测定浓度。10% SDS-PAGE 胶上样，电泳分离，湿转将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶室温封闭1 h。分别用SIRT1、ERK1/2、P-ERK1/2、P90RSK、CREB 一抗孵育，4 ℃过夜。TBST 漂洗3 × 10 min。二抗室温孵育1 h，TBST 漂洗3 × 10 min。暗室中ECL 发光液显影，采集各条带及其内参的灰度值，得到各样本蛋白的灰度比值。

1.6 统计学方法符合正态分布数据均用（）表示，应用GraphPad Prism 7 统计分析软件对多组间数据进行单因素方差分析，Post Hoc Test 选用LSD 方法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 越鞠甘麦大枣汤对PPD 小鼠抑郁样行为的影响

2.1.1 越鞠甘麦大枣汤增加PPD 小鼠糖水偏好

与对照组（Con）相比，模型组（Mod）小鼠的糖水偏好下降（P＜0.05）；与模型组相比，越鞠甘麦大枣汤（YG）和艾司西酞普兰（Es）给药均能明显增加小鼠的糖水偏好（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠的糖水偏好Fig.1 The sucrose preference of mice in each group

2.1.2 越鞠甘麦大枣汤减少PPD 小鼠强迫游泳不动时间与对照组相比，模型组小鼠强迫游泳测试的不动时间增加（P＜0.01）；与模型组相比，越鞠甘麦大枣汤和艾司西酞普兰给药均能降低小鼠的不动时间（P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠的强迫游泳不动时间Fig.2 Immobility time of mice in each group in forced swimming test

2.1.3 越鞠甘麦大枣汤增加PPD小鼠体质量与对照组相比，模型组小鼠的体质量减少（P＜0.05）；与模型组相比，越鞠甘麦大枣汤和艾司西酞普兰均能增加小鼠的体质量（P＜0.05）。见图3。

图3 各组小鼠的体质量Fig.3 The body weight of mice in each group

2.2 越鞠甘麦大枣汤对PPD 小鼠海马SIRT1-ERK1/2 信号相关蛋白表达的影响与对照组相比，模型组小鼠海马中SIRT1（图4A）、P-ERK1/2（图4B）、P90RSK（图4C）及CREB（图4D）的表达均降低（P＜0.05），ERK 表达无明显变化（P＞0.05），P-ERK/ERK 降低（P＜0.05）。与模型组相比，越鞠甘麦大枣汤增加小鼠海马SIRT1、P-ERK/ERK、P90RSK 及CERB 的表达（P＜0.05），与艾司西酞普兰作用相似（P＜0.05）。

3 讨论

研究表明，情绪和焦虑病史是导致母亲产后出现抑郁症状的高危因素［1］，抑郁动物表现出自发活动总路程减少、糖水偏好降低、强迫游泳不动时间增加等抑郁行为［11-12］。其中，反应快感缺失的糖水偏好降低和反应行为绝望的强迫游泳不动时间增加是抑郁动物的核心症状。本研究选取了糖水偏好测试和强迫游泳实验作为判断造模成功与否的主要依据，并根据前期实验基础建立产前应激诱导的PPD 模型［13］。本研究结果表明，模型组小鼠表现出糖水偏好降低，强迫游泳不动时间增加，体质量减少等抑郁样行为，提示造模成功。越鞠甘麦大枣汤和艾司西酞普兰给药均能增加小鼠糖水偏好，降低小鼠强迫游泳不动时间并增加小鼠的体质量，表明越鞠甘麦大枣汤与艾司西酞普兰均表现出抗抑郁治疗作用。

图4 各组小鼠海马中SIRT1-ERK1/2 信号通路相关蛋白表达水平Fig.4 Expression level of SIRT1-ERK1/2 signaling pathway related proteins in the hippocampus of mice in each group

SIRT1 最初被鉴定为组蛋白脱乙酰基酶，在海马、丘脑、小脑和大脑皮层中高表达［14］。SIRT1 参与神经元存活的调节，具有神经保护作用。在神经生长过程中，SIRT1 参与神经元轴突生长、树突分枝［6，15］，并调节海马突触可塑性和突触形成［16］。有研究认为，SIRT1 的抑制参与了抑郁症的发病过程。LIU 等［17］研究发现慢性不可预测轻度应激降低雄性C57BL/6 小鼠海马SIRT1mRNA 的表达水平。LEI 等［18］发现SIRT1 内侧前额叶皮层特异性敲除诱导小鼠出现抑郁样行为，而SIRT1 激活剂SRT2104 可逆转小鼠的快感缺失和行为绝望。

目前研究［19］认为，ERK 途径参与了SIRT1 介导的神经保护作用。ERK 作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成员之一，参与神经元存活和神经保护的转导途径［8，20］。SIRT1 激活增强ERK 活化，协同发挥神经保护作用［21］。此外，ERK 信号激活后作用于其直接底物RSK，两者协同作用共同入核，促进下游转录因子CREB 活化以调节基因转录，参与多种生物学效应的形成过程［22-23］。不同造模方式诱导的抑郁动物模型中，ERK1/2-CREB 信号显著下调，而抗抑郁药可激活ERK1/2-CREB 信号通路，增加磷酸化ERK1/2的表达水平［24-26］。在本研究中，PPD模型组小鼠海马SIRT1、P-ERK/ERK、P90RSK、CREB 等蛋白的表达均明显降低，而越鞠甘麦大枣汤给药能显著上调相关蛋白的表达，提示孕前慢性应激诱导小鼠出现产后抑郁症状，其发病机制可能与小鼠海马SIRT1-ERK1/2 信号系统被抑制有关，中药可能通过激活SIRT1-ERK1/2 信号通路，增强神经元存活能力，提高神经保护作用及改善神经可塑性从而产生抗抑郁作用。学者研究发现5-羟色胺再摄取抑制剂西酞普兰可上调人神经祖细胞SIRT1 表达，临床实验结果表明西酞普兰可逆转重度抑郁症患者血液样本中SIRT1 mRAN 的表达降低［27］。在本研究中，艾司西酞普兰表现出相似的上调SIRT1 等蛋白表达的作用。然而临床上艾司西酞普兰治疗的患者易出现腹泻、失眠等不良反应［28］，而中药在临床治疗中副作用少，安全性高，或许能为PPD 的药物研发提供新的选择和方向。

综上所述，本研究表明越鞠甘麦大枣汤能改善PPD 小鼠的抑郁样行为，且其可能是通过激活海马SIRT1-ERK1/2 信号发挥作用的。本研究首次提出SIRT1 参与了PPD 的发病过程且中药可通过影响相关蛋白表达而发挥抗抑郁作用，为临床防治PPD 提供了新的研究思路。但本实验只是初步探讨了越鞠甘麦大枣汤影响小鼠海马相关蛋白的表达，未对其具体的作用机制需要进一步的探讨。在接下来的研究中，将采用SIRT1 基因敲除和过表达或使用相应拮抗剂的方式来研究SIRT1在PPD 发病机制中发挥的作用以及药物的治疗机制。