陈凯　李纪顺　王贻莲　魏艳丽　扈进冬　杨合同

摘要 為比较哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2在贮存稳定性及生防活性方面的差异，采用平板菌落计数法检测木霉可湿性粉剂中分生孢子的存活率，测定菌株的生物学特性，并在温室条件下评价制剂对番茄立枯病的防治效果。结果表明，分生孢子存活率达80.0%时，在5℃和室温（2℃～36℃）下，L-15可湿性粉剂的货架期分别为24个月和9个月，显著高于LTR-2可湿性粉剂的12个月和6个月。L-15的潮霉素抗性在贮存后稳定遗传，其β-1， 4-葡聚糖酶水解活性、几丁质酶水解活性及平板拮抗活性较LTR-2明显提高。5℃贮存60月后，L-15可湿性粉剂10×和100×稀释处理对番茄立枯病的温室防治效果分别达89.27%和86.52%，与LTR-2处理间存在极显著性差异（P<0.01）。重组株L-15的货架期和生防活性较野生株LTR-2明显提高，在生物防治领域具有潜在应用价值。

关键词 哈茨木霉重组株L-15; 哈茨木霉野生株LTR-2; 可湿性粉剂; 货架期; 番茄立枯病; 防治效果

中图分类号：

S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019223

Storage stability and biocontrol efficiency of Trichoderma harzianum recombinant strain L-15 and wild strain LTR-2

CHEN Kai， LI Jishun*， WANG Yilian， WEI Yanli， HU Jindong， YANG Hetong

（Institute of Ecology， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），

Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology， Jinan 250103， China）

Abstract

To compare storage stability and biocontrol efficiency between Trichoderma harzianum recombinant strain L-15 and wild strain LTR-2， the conidiospore survival rate of wettable powder during storage period was determined by using plate colony counting method; biological characteristics of both strains were investigated， and the biocontrol efficiency of wettable powder against tomato Rizoctonia rot was evaluated under greenhouse conditions. The results demonstrated that， when the survival rate of conidiospores was maintained at 80.0%， the shelf life of L-15 wettable powder reached 24 and 9 months at 5℃ or room temperature （2℃-36℃）， respectively， which were significantly higher than those of LTR-2 wettable powder （12 and 6 months， respectively）. The hydrolytic activity of β-1，4-glucanase and chitinase in L-15 and its antagonistic activity on plate were obviously enhanced compared to LTR-2， and the introduced hygromycin resistance of L-15 was also stably inherited over storage period. Under greenhouse conditions， the biocontrol efficiencies against tomato Rizoctonia rot of 10 and 100-times dilution of L-15 wettable powder after 60 months at 5℃ were 89.27% and 86.52%， respectively， which were significantly different from LTR-2 wettable powder （P<0.01）. In summary， T.harzianum recombinant strain L-15 had an improved storage stability and biocontrol efficiency compared with wild strain LTR-2 and thus has a potential for biocontrol application.

Key words

Trichoderma harzianum recombinant strain L-15; Trichoderma harzianum wild strain LTR-2; wettable powder; shelf life; tomato Rizoctonia rot; biocontrol efficiency

木霉Trichoderma spp.是自然界广泛分布的生防真菌，自1932年Weindling[1]发现木霉的拮抗作用后，国内外专家、学者在木霉生防和应用方面做了大量工作，表明木霉具有多种生防机制：可在多种逆境下生存和定殖、有效利用环境中的营养物质、抑制植物病害发生、促进植物生长和诱导植物产生系统抗性[2-4]。木霉至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用，目前国际上有60多个国家使用100多种含有木霉成分的生物制剂产品[5]。

虽然自1960年木霉的生物防治功能被世界关注，但其商品化进程仍存在诸多问题：主要是缺乏合适的剂型，田间应用效果不理想以及制剂保质期短[6]。据报道，以滑石粉、草炭、褐煤以及高岭土为载体，木霉制剂的保质期只有3～8个月[7-9]。以液体石蜡为载体，15～35℃保存6个月，木霉孢子存活率为22.4%;4℃保存11个月，木霉孢子存活率仅为8.8%[10]。在去离子水中保存1年，木霉孢子存活率为75%;2年则为60%[11]。微胶囊是目前保存效果较好的木霉剂型，但12～14个月后，微胶囊中孢子含量也只有106 cfu/g[6， 12]，且微胶囊制备工艺较复杂，应用效果不理想，生产成本较高。

2016年公布的中华人民共和国农业行业标准NY/T 2888.1-2016和NY/T 2888.2-2016规定：木霉制剂5℃保存12个月或20～25℃保存6个月，贮存稳定性不低于80%[13-14]，现有木霉制剂很难达到标准要求。为解决上述问题，应加大木霉研发力度，构建具有抗逆、拮抗能力和诱导抗性强的广谱生防工程菌株;建立高密度、低成本、无污染的规模化发酵生产工艺;并重点解决活菌制剂的贮存问题[15-16]。

凹凸棒土（attapulgite）是一种具链层状结构的含水富镁铝硅酸盐黏土矿物，利用凹凸棒土为载体制备的微生物制剂保质期长，在土壤中释放缓慢，从而延长药效，降低生产成本[17-18]。本文以前期得到的广谱高效木霉重组株L-15为研究对象，以凹凸棒土为载体制备木霉的可湿性粉剂，探索基因重组后对木霉制剂贮存稳定性的影响，并评价其贮存后的生防效果，为进一步推广应用及商品化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

哈茨木霉T.harzianum野生株LTR-2，本实验室分离保存，具有多种生防活性，无潮霉素hygromycin抗性[19]。哈茨木霉重组株L-15，系以LTR-2为出发菌株，利用限制性内切酶介导法构建而成，包含外源β-1，4-葡聚糖酶基因glu14和几丁质酶基因chi42，具有潮霉素抗性（Hyg 200 μg/mL）[20]。

指示菌为本室保存的13种植物病原真菌：致病疫霉Phytophthora infestans、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、平脐蠕孢Helminthosporium sativum、白腐盾壳霉Coniothyrium diplodiella、尖镰孢萎蔫专化型Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum、串珠镰孢F.moniliforme、木贼镰孢F.equiseti、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、小葡萄座腔菌B.parva、禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis、立枯丝核菌R.solani。

1.2 试剂与培养基

潮霉素B（上海生物工程技術服务有限公司），50%多菌灵可湿性粉剂（江苏宝灵化工股份有限公司），番茄品种为‘粉番茄（济南大江种子有限公司）。

1 mg/mL刚果红：1 g刚果红溶于1 L蒸馏水中，现配现用。

1 mol/L NaCl：58.5 g NaCl溶于1 L蒸馏水中，现配现用。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

PDAT培养基：PDA培养基中添加Triton X-100 0.5 mL/L。

PDAH培养基：PDA培养基中添加Hyg 200 μg/mL。

PDAHT培养基：PDAH培养基中添加Triton X-100 0.5 mL/L。

小麦培养基：小麦种子用自来水室温浸泡24 h，除去石子杂草等，沥干水分，分装250 mL组培瓶，121℃灭菌1 h备用。

几丁质培养基：葡萄糖0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、（NH4）2SO4 1 g、K2HPO4 1.36 g、胶体几丁质10 g、琼脂15 g、Triton X-100 0.5 mL、蒸馏水1 000 mL。

CMCNa培养基：葡萄糖0.5 g、KH2PO4 15 g、（NH4）2SO4 5 g、CaCl2 0.6 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、MnSO4·H2O 0.001 6 g、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g、CoCl2·6H2O 0.003 7 g、CMCNa（羧甲基纤维素钠）5 g、琼脂15 g、Triton X-100 0.5 mL、蒸馏水1 000 mL。

1.3 木霉可湿性粉剂制备

分别在PDA和PDAH培养基平板上活化木霉重组株L-15和野生株LTR-2，培养完毕后刮取分生孢子制备孢子悬浮液107cfu/mL，按1%接种量接种灭菌的小麦培养基，25℃培养4 d至分生孢子布满整个培养基，用无菌生理盐水洗脱分生孢子，7 000 r/min离心10 min后收集分生孢子备用。

凹凸棒土提前于180℃烘干2 h，以其为载体制备L-15和LTR-2的可湿性粉剂：凹凸棒土95%、葡萄糖0.5%、黄原胶0.25%、十二烷基苯磺酸钠0.25%、羧甲基纤维素钠0.5%，几丁质0.5%，分生孢子3%。可湿性粉剂初始活分生孢子含量不低于10亿/g，制剂含水量控制在5%左右。

1.4 木霉可湿性粉剂贮存稳定性检测

将混合均匀的上述可湿性粉剂分装在小型铝箔袋中，每袋10 g，用塑料薄膜封口机封口，分别置于5℃和室温（2～36℃）贮存，间隔3个月取样1次，每种制剂3袋重复，采用稀释涂布平板法检测可湿性粉剂中的活分生孢子含量，计算存活率，L-15检测培养基为PDAHT，LTR-2检测培养基为PDAT。

孢子存活率%=c/c0×100%;

其中c为不同贮存期可湿性粉剂的活孢子数，c0为可湿性粉剂的初始活孢子数。

1.5 木霉重组株L-15和野生株LTR-2的生物学特性

1.5.1 木霉菌株潮霉素抗性及培养特性检测

生物学特性测定用木霉重组株L-15来自5℃下贮存60个月的L-15可湿性粉剂，野生株LTR-2来自

-80℃超低温冰柜保存菌种。分别在PDAH和PDA培养基平板上培养L-15和LTR-2，观察其生长速率及产孢性能，检测贮存60个月后L-15中潮霉素基因的遗传稳定性。

1.5.2 基因重组对L-15水解酶活性的影响

在几丁质培养基和CMCNa培养基上接种1.5.1中分离到的L-15和LTR-2，25℃培养6 d后，CMCNa平板先用1 mg/mL刚果红染色20 min，再用1 mol/L NaCl沖洗2次，观察水解圈大小;几丁质平板直接观察水解圈大小。

1.5.3 基因重组对L-15抑菌活性的影响

利用对峙培养法测定1.5.1中L-15和LTR-2对供试植物病原真菌的抑菌活性，用直径5 mm打孔器打取木霉与病原真菌菌落边缘的菌丝块，然后对接在PDA平板两端，两个菌块相距70 mm，以只接种病原真菌为对照，25℃对峙培养6 d，观察两者之间的拮抗情况，计算抑制率。

抑制率=（r02-r2）/r02×100%;

其中r0为对照病菌生长半径，r为与木霉对峙培养的病菌生长半径。

1.6 木霉可湿性粉剂对番茄立枯病的温室防治效果

生防菌剂为5℃贮存60个月的L-15可湿性粉剂（分生孢子含量为2.0亿/g）;对照菌剂为新配制的LTR-2可湿性粉剂，分生孢子含量调整为2.0亿/g。每种菌剂设3个稀释梯度：10×、100×及1 000×稀释，试验设8个处理：L-15/10×、L-15/100×、L-15/1 000×、LTR-2/10×、LTR-2/100×、LTR-2/1 000×、多菌灵/800×、清水对照。每处理3个重复。

利用小麦培养基培养病原真菌R.solani，待菌丝布满麦粒后，按1 g/kg的剂量均匀混入健康大田土中，制成带病盆栽土，分装干净花盆。番茄在育苗钵中提前育苗，选取生长健壮、大小适中的幼苗进行移栽，每盆10株，每处理3盆，分别用上述不同浓度处理菌剂及多菌灵灌根500 mL/盆。

在人工气候室内于光周期为L∥D=10 h∥14 h，昼夜温度为25/18℃，空气相对湿度为50%～70%的条件下，对盆栽样品进行栽培管理。28 d后进行番茄立枯病病害调查，统计防治效果。

立枯病病害调查分级标准：0级，全株无病;1级，茎基部有小病斑，占茎围的25%以下;2级，茎基部病斑较大，约占茎围的25%～50%;3级，茎基部病斑较大，约占茎围的50%以上，但尚未破坏整个茎围;4级，茎基部病斑占据全部茎围，植株死亡。

病情指数=Σ（各级病株数×相对病级数值）/（调查总株数×4）×100;

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.7 数据统计与分析

数据采用Excel 2013和SPSS 21.0统计软件进行Duncan氏多重比较。

2 结果与分析

2.1 木霉可湿性粉剂的贮存结果

木霉重组株L-15和野生株LTR-2可湿性粉剂中初始活分生孢子含量均为10.0亿/g，制剂含水量5.5%，在10-6数量级上未检出杂菌，制剂贮存结果见图1。在室温（2～36℃）和5℃两种贮存条件下，可湿性粉剂中分生孢子存活率均随时间的延长呈降低趋势，5℃贮存效果好于室温。室温下，LTR-2贮存21个月基本检测不到分生孢子（孢子存活率<5.0%），L-15贮存30个月基本检测不到分生孢子。5℃下，LTR-2贮存39个月基本检测不到分生孢子，L-15贮存结果较

好，至72个月才基本检测不到分生孢子。重组株L-15可湿性粉剂在两种条件下的贮存稳定性均好于野生株LTR-2。

以分生孢子存活率80.0%、50.0%和20.0%为检测指标，发现不同处理可湿性粉剂对应的贮存期不同。在5℃条件下：L-15的贮存期分别为24、39和60个月;LTR-2的贮存期分别为12、18和30个月。在室温条件（2～36℃）下：L-15的贮存期分别为9、15和21个月;LTR-2的贮存期分别为6、9和15个月。另外，5℃下L-15贮存3月内分生孢子存活率达100.0%，结果见表1。按中华人民共和国农业行业标准NY/T 2888.2-2016贮存稳定性的要求，LTR-2可湿性粉剂基本达到标准要求，L-15可湿性粉剂明显高于标准，5℃下货架期可达24个月。

2.2 木霉重组株L-15和野生株LTR-2的生物学特性

2.2.1 木霉菌株的潮霉素抗性及培养特性

野生株LTR-2对潮霉素敏感，在PDAH培养基上25℃培养5 d不生长，在PDA培养基上生长速率为21 mm/d，培养5 d后75%的平板上布满分生孢子。

从5℃下贮存60个月的木霉重组株L-15可湿性粉剂中分离得到的L-15，接种PDA和PDAH培养基后，25℃下生长速率分别为23 mm/d和22 mm/d，培养5 d后分生孢子产量略高于LTR-2，L-15在两种培养基上的生长速率和产孢情况差别不大，在PDA上的产孢量相对稍多，结果见图2，说明贮存后L-15仍具有潮霉素抗性及遗传稳定性。

2.2.2 基因重组对L-15水解酶活性的影响

野生株LTR-2本身有一定的β-1，4-葡聚糖酶和几丁质酶水解活性，但水解圈不明顯，而木霉重组株L-15的两种水解酶活性较LTR-2明显提高，水解圈较大，结果见图3。

2.2.3 基因重组对L-15抑菌活性的影响

木霉重组株L-15和野生株LTR-2在PDA平板上对供试的13种植物病原真菌均有拮抗作用，L-15的拮抗效果较好，对同一种病原真菌的抑制率较LTR-2均有所提高。L-15对P.infestans、

F.oxysporum、F.moniliforme、V.dahliae、R.cerealis、P.aphanidermatum及R.solani的抑制率与LTR-2存在极显著性差异（P<0.01），L-15对B.cinerea、B.parva、F.equiseti及C.diplodiella的抑制率与LTR-2存在显著性差异（P<0.05），结果见图4。说明通过基因重组，增强了L-15的抗菌活性。

2.3 木霉可湿性粉剂对番茄立枯病的温室防治效果

木霉重组株L-15可湿性粉剂5℃下贮存60个月，制剂中活分生孢子含量为2.0亿/g，贮存后L-15制剂对番茄立枯病的温室防治效果见表2，不同处理间病情指数差异较大，各处理组的病情指数与清水对照间存在极显著性差异（P<0.01），其中L-15/10×和L-15/100×两组处理的病情指数与其他处理间也存在极显著性差异（P<0.01），对番茄立枯病的防治效果分别达到了89.27%和86.52%，但两者间无显著性差异。

木霉重组株L-15可湿性粉剂为5℃贮存60个月，野生株LTR-2可湿性粉剂为新配制，同一稀释度的L-15与LTR-2处理间均存在极显著性差异（P<0.01），说明在有效活孢子数相同的情况下，重组菌株L-15的生防效果明显好于野生株LTR-2，贮存后不影响重组株的活性。

3 讨论

木霉是一类重要的生防菌，产品货架期短和防治效果不稳定是制约木霉推广应用的技术瓶颈。为了研发货架期长、生防性能高的木霉制剂，本文利用木霉重组株L-15制备可湿性粉剂，贮存结果表明，制剂中分生孢子存活率不低于80.0%时，室温贮存期为9个月，5℃下为24个月;而野生株LTR-2可湿性粉剂分生孢子存活率不低于80.0%时，室温贮存期为6个月，5℃下为12个月。L-15可湿性粉剂在5℃下延长贮存期至60个月，分生孢子存活率不低于20.0%。木霉重组株L-15可湿性粉剂的贮存结果明显好于野生株LTR-2，高于前人报道的分生孢子制剂的保质期限[7-9， 21-22]，也好于张晶晶和Mishra等研制的厚垣孢子制剂[23-24]。室温下贮存期短的原因可能是温度范围变化较大（2～36℃），且高温期较长，在高于25℃的高温下孢子自身消耗严重。木霉重组株L-15的贮存稳定性较野生株LTR-2明显提高，推测原因可能是外源基因的随机插入，导致了某些基因位点发生突变，分生孢子壁结构与组成更稳固，进而较野生株LTR-2更耐贮存，具体原因有待进一步探讨。

木霉重组株L-15具有外源β-1，4-葡聚糖酶基因glu14和几丁质酶基因chi42，可有效降解病原真菌的细胞壁，抑菌活性测定结果表明，L-15对供试病原真菌的抑制率均高于LTR-2。温室条件下，在有效活孢子数相同的情况下，L-15制剂对番茄立枯病的生防效果明显好于LTR-2，贮存后不影响重组菌株的活性。两组处理L-15/10×和L-15/100×对番茄立枯病的防治效果较好，与其他处理间存在极显著性差异（P<0.01），但两者间无差异，综合成本和防效考虑，L-15可湿性粉剂的分生孢子含量为2.0亿/g时，灌根时以稀释100×为最优选使用剂量。

截至2018年4月，我国已登记注册的微生物农药产品509个，其中木霉15个，占比只有2.9%[25]，与欧美发达国家相比差距较大。原因除政策因素和企业因素外，与生物农药产品自身的特点有很大的关系，主要缺点是产品见效慢、防治谱窄、抗逆性（如高温、干燥、紫外辐射等）和耐贮性（常温1年以上）差[3]。故应加大研发力度，选育广谱高效木霉菌株，研制适合商品化生产的木霉制剂。本文从基因重组的角度对木霉的货架期和防效进行研究，为制剂研制提供了科学依据。下一步将对木霉重组株L-15进行安全性评价，争取高效重组菌株的进一步应用推广。

参考文献

[1] WEINDLING R. Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi [J]. Phytopathology， 1932， 22（8）： 837-845.

[2] KUMAR G， MAHARSHI A， PATEL J， et al. Trichoderma： a potential fungal antagonist to control plant diseases [J]. SATSA Mukhapatra-Annual Technical Issue， 2017， 21： 206-218.

[3] HARMAN G E， HOWELL C R， VITERBO A， et al. Trichoderma species-opportunistic， avirulent plant symbionts [J]. Nature Reviews Microbiology， 2004， 2（1）： 43-56.

[4] 陈捷， 朱洁伟， 张婷， 等. 木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展[J]. 中国生物防治学报， 2011， 27（2）： 145-151.