王卉，刘庆菊，韩平

1.北京农业质量标准与检测技术研究中心（北京 100097）；2.农业部农产品质量安全风险评估实验室（北京）（北京 100097）；3.农产品产地环境监测北京市重点实验室（北京 100097）

饲养奶牛过程中需使用兽药来保障奶牛的健康。然而，兽药使用的不合理，如用药量过大、不按疗程用药、随意配药、给药途径错误、未严格执行休药期规定、违规使用人用药或原料药等，都可能使牛奶中出现兽药残留[1-2]，兽药残留会影响人体健康，产生致毒、致癌、致畸等不良影响，并且会增加人体对微生物的耐药性[3-4]。因此，有必要监控牛奶中兽药的残留情况，以保障牛奶质量。

根据农业农村部第235号和2292号公告对禁限用兽药的规定[5-6]，在牛奶中，氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、沙氟沙星、达氟沙星、羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、青霉素G、邻氯青霉素、头孢噻呋、西马特罗、沙丁胺醇、甲硝唑、呋喃它酮、呋喃唑酮、群勃龙、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、己烯雌酚、氯丙嗪等23种兽药需要重点监测，它们分别属于喹诺酮类、β-内酰胺类、β-受体激动剂、硝基咪唑类、硝基呋喃类、性激素类、吩噻嗪类等。为保障牛奶的食用安全，需要严格测定牛奶中以上兽药含量。

牛奶中兽药的检测方法主要有微生物检测法、免疫分析法、适配体传感器检测法和液质联用法等[7-10]，其中，微生物检测法在检测的灵敏度上有待进一步提高，免疫分析法和适配体传感器检测法等方法在检测稳定性方面有待进一步改善，而液质联用检测法具有耗时短、测量范围广、稳定性好等优势[11-16]，特别在多种兽药的同时检测中优势明显。因此，试验选择乙腈（含2%甲酸）作为提取溶剂结合固相萃取小柱，对牛奶中的23种兽药残留进行提取，建立UPLCMS/MS检测牛奶中23种兽药残留的方法。方法操作简便、快速、准确，可以满足牛奶中23种兽药分析检测的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶（市售）；标准品：氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、沙氟沙星、达氟沙星、羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、青霉素G、邻氯青霉素、头孢噻呋、西马特罗、甲硝唑、呋喃它酮、群勃龙、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、氯丙嗪、沙丁胺醇、呋喃唑酮、己烯雌酚（纯度均在98%以上，德国Dr. E公司）；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸铵（均为质谱纯，美国Fisher公司）；超纯水；固相萃取小柱Oasis PRiME HLB（200 mg，6 cc，美国Waters公司）。

1.2 仪器与设备

ACQUITY超高效液相色谱仪串联三重四级杆Xevo TQS质谱仪（美国Waters公司）；ME104E电子天平（最大称量120 g，精度0.000 1 g，瑞士梅特勒公司）；Vortex Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）；PHS-3C精密pH计（上海雷磁仪器厂）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；3-30k离心机（德国Sigma公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 牛奶中兽药的提取

称取1 g牛奶，加入4 mL乙腈（含2%甲酸），充分混合，在7 000 r/min下离心5 min，取3 mL上清液进行SPE净化。

1.3.2 净化

先用3 mL乙腈（含2%甲酸）通过Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行活化。取3 mL牛奶样品上清液，使其通过小柱，取2 mL上样后的流出液于10 mL离心管中，在温和氮气流下挥干溶剂，用1 mL 5%甲醇水溶液复溶，过0.22 μm微孔滤膜，再将其转移至样品瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 兽药标准溶液的配制

分别准确称取10 mg兽药标准品，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL标准储备液，在-20 ℃保存，兽药混合标准工作溶液现用现配。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），进样体积5 μL；柱温45 ℃；流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为甲醇（含0.1%甲酸），流速0.45 mL/min，采用梯度洗脱程序：0～0.15 min，2% B；0.15～1.95 min，2%～26% B；1.95～2.95 min，26%～35% B；2.95～7.50 min，35%～99% B；7.50～8.00 min，99% B；8.00～8.01 min，99%～2% B；8.01～10.00 min，2% B。

1.3.5 质谱条件

采用ESI源，电喷雾模式采用ESI+和ESI-这2种模式；毛细管电压3.5 kV；离子源温度150 ℃；锥孔气流速150 L/h；脱溶剂气温度600 ℃；脱溶剂气流速1 000 L/h；碰撞气流速（氩气）0.15 mL/min。

1.4 数据处理

Masslynx 4.1数据采集分析软件。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

在牛奶的兽药残留提取试验中，常用乙腈作为提取溶剂[17-18]。乙腈不仅可以提取兽药化合物，还能沉淀牛奶中的蛋白质。分别用乙腈（含2%甲酸）和80%乙腈（含0.2%甲酸）溶液对牛奶样品中的兽药残留进行提取，结果显示，乙腈（含2%甲酸）的提取效果更好，平均回收率为95.67%，而80%乙腈（含0.2%甲酸）溶液的平均提取回收率为85.62%，因此试验选择乙腈（含2%甲酸）作为提取溶剂。由于测定的23种兽药化学性质差异较大，不适宜采用吸附-淋洗-洗脱的方式净化，所以选择用固相萃取小柱吸附杂质，作为目标化合物通过的方式净化。有研究发现Oasis PRiME HLB小柱对牛奶提取液中的蛋白、脂肪和磷脂等杂质的吸附效果较好[19-21]。因此，选用Oasis PRiME HLB对牛奶样品进行净化处理，并对上样体积进行优化。结果表明，上样体积分别为3和4 mL时，平均回收率分别为95.67%和94.89%，无明显的区别，由于体积大时，收集流出液所需时间长，因此选择上样体积3 mL进行净化。

2.2 色谱条件优化

选取ACQUITY UPLC BHE C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱和ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，通过比较2种色谱柱对23种兽药化合物的保留情况，并综合考虑化合物的保留时间、离子化效率和分段扫描等因素，发现ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱对目标化合物的分离效果更好，因此选择该色谱柱进行试验。流动相极性和pH对化合物的保留和分离影响较大，试验比较甲醇-水、乙腈-水、甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸）、甲醇（含0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵）-水（含0.1%甲酸）等不同流动相条件，试验发现以甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）为流动相时，化合物的分离效果最好，灵敏度最高，酸度低时，喹诺酮类化合物会出现拖尾现象。因此，试验采用此流动相优化梯度洗脱程序。

2.3 质谱条件的优化

将23种兽药分别配制成200 μg/L单标溶液，液相流速设为10 μL/min，使用Masslynx 4.1软件的调谐功能，找到23种化合物的母离子和子离子，通过优化碰撞能、去簇电压、锥孔电压等，确定各离子的最佳质谱参数，如表1所示。其中，己烯雌酚是在ESI-离子化模式下进行检测的，其他化合物均在ESI+离子化模式下检测，对23种兽药标样进行测定时，其出峰时间见表1，MRM色谱图如图1所示。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围、线性方程、检测限和定量限

在最佳仪器条件下，配制不同浓度的混合标准工作溶液，以定量离子对的峰面积为纵坐标（y），以标准品的浓度为横坐标（x）绘制标准工作曲线，计算得到化合物的线性方程、相关系数、线性范围，以化合物信噪比S/N=3时对应的浓度作为最低检测限（LODs），以标准曲线上的最低点作为定量限（LOQs），结果列于表2。

2.4.2 准确度和精密度

取不含上述23种待测兽药的牛奶作为基质，进行低、中、高3个浓度水平的添加回收试验，重复测定6次，加标回收试验结果见表3，加标回收率为70.98%～118.63%，相对标准偏差为0.14%～11.55%。

表1 目标化合物的质谱分析参数

图1 23种兽药化合物混合对照品的MRM色谱图

表2 23种药物线性回归方程、相关系数、检出限和定量限

表3 23种兽药化合物的回收率和精密度结果（n=6）

3 结论

建立超高效液相色谱-串联质谱测定牛奶中23种禁限用兽药的方法，采用乙腈（含2%甲酸）作为提取溶剂，用Oasis PRiME HLB小柱进行净化处理，方法灵敏度高，操作方便。方法的线性、检测限和定量限均符合残留检测的要求。