耿敬章 ，马瑞，许亚丽，贺博，唐德剑，杨水云*

1.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西省营养与健康工程研究中心（西安 710049）；2.陕西理工大学生物科学与工程学院（汉中 723000）；3.农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室（安康 725000）

硒为人体必不可少的微量元素，具有抗氧化、增强免疫、调节蛋白质合成及维持体内氧化还原反应平衡的重要作用[1]。随着对营养健康的日益重视，富硒产品日益受到青睐。富硒产品以硒元素含量高而出名，其中添加的硒形式有无机硒和有机硒2种，无机硒一般指亚硒酸盐和硒酸盐，有机硒多与蛋白质或氨基酸结合而成，具有代表性的是硒代硫蛋氨酸[2-3]。大量研究表明无机硒摄取后会产生较大副作用，有机硒形式才是对人体安全且生物利用度较高的硒形式。在利益驱使下，不良商人会用无机硒冒充有机硒富硒产品，以次充好，如用高浓度硒酸盐溶液浸泡鸡蛋获取“富硒鸡蛋”[2]，在茶叶上面喷洒硒酸盐喷雾提高硒含量等[4-5]，这不仅损害消费者利益，更对消费者身心安全带来威胁，为健全市场监管机制，预防含过量无机硒产品的危害，建立一个科学有效的无机硒在总硒中占比的检测方法，检验富硒产品有机硒（或无机硒）在总硒中占比，评估富硒食品的安全可靠性就显得非常重要[6-7]。

试验主要针对富硒鸡蛋有机硒占比测定方法而展开研究，利用国家标准中氢化物原子荧光光谱法对鸡蛋中总硒进行测定，通过鸡蛋内容物的性质优化无机硒和有机硒的分离方法，用氢化物原子荧光光谱法对无机硒含量进行测定，用差减法获得有机硒占比数据，建立有效的测定鸡蛋产品中有机硒的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒鸡蛋（市售）；三氯乙酸、NaOH、硼氢化钾、环己烷、盐酸、硝酸等（均为分析纯）；硒标准液（质量浓度1 mg/mL，国家标准物质中心），取0.02 mL的1 mg/mL硒标准样品溶液定容于100 mL，低温保存。

1.2 仪器与设备

湘仪H1650R离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；EHD-24电热赶酸仪（北京东航科仪仪器有限公司）；Mars6高通量密闭微波消解系统（美国CEM公司）；LC-AFS 6500液相色谱-原子荧光联用仪（北京海光）；UV-8000S紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；DHG-914OA鼓风干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）；BCD-258WDPM无霜冷藏冷冻箱（青岛海尔股份有限公司）；KH-500DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.3 溶液配制

50%三氯乙酸母液：称取50 g三氯乙酸溶解在100 mL去离子水中。0.02 μg/mL硒标准液：取0.02 mL的1 000 μg/mL硒标准样品溶液定容于100 mL，低温保存。1 μg/mL硒使用液：取0.1 mL的1 000 μg/mL硒标准样品溶液定容于100 mL，低温保存。5%盐酸溶液：量取50 mL盐酸，缓慢加入950 mL去离子水中，混匀。20%盐酸溶液：量取20 mL盐酸，缓慢加入80 mL去离子水中，混匀。5 g/L氢氧化钠溶液：称取5 g氢氧化钠，溶于1 000 mL去离子水中，混匀。8 g/L硼氢化钾碱溶液：称取8 g硼氢化钾，溶于5 g/L氢氧化钠溶液中，混匀，现配现用。

1.4 总硒检测

参照GB 5009.93—2017《国家食品安全标准食品中硒的测定》执行[8]。

绘制硒标准曲线，以盐酸溶液（20∶80）为载流，硼氢化钾碱溶液（20 g/L）为还原剂，设置硒标准系列浓度1.0，2.0，4.0，8.0，12.0和20.0 μg/L，选取自动配制硒标准溶液。以质量浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制作标准曲线。

称取0.5 g（精确至0.001 g）样品，加入消化管中，加8 mL硝酸于70 ℃预处理30 min，加2 mL过氧化氢于130 ℃预处理30 min，转移管至微波消解仪中。设置条件：15 min升温至180 ℃，恒温消解30 min，15 min降温。待消解结束冷却后，放入赶酸仪加热至近干，加2.5 mL盐酸和2.5 mL去离子水，继续加热至近干，转移至25 mL容量瓶中，用去离子水定容混匀，并做试剂空白待测。在样品与标准系列溶液测定条件相同情况下，将空白溶液和试样溶液分别导入仪器，测定其荧光强度并与标准曲线对比定量。每种样品均做3个平行样和空白对照。

1.5 蛋清中无机硒的分离及测定

取1.5 mL三氯乙酸溶液（浓度50%），加入0.5 g蛋清样品至5 mL离心管，加去离子水定容（调节终浓度至最佳浓度），并在相对离心力10 000 g条件下离心5 min，分离出大颗粒蛋白沉淀，收集上清液。所得上清用环己烷萃取，去除中间杂质层（多为小分子蛋白质和氨基酸），继续萃取，直到界面清亮为一条线，收集水溶液，并称其质量。用氢化物原子荧光光谱法测定水溶液无机硒含量。

1.6 蛋黄中无机硒的分离及测定

取2 mL最佳聚乙二醇溶液（聚乙二醇分子量6 000），与0.5 g蛋黄原液直接混合于离心管，然后通过静置，使蛋黄油脂发生相互凝集而自然沉降，并在相对离心力10 000 g条件下离心5 min，分离油脂沉淀，收集上清液。将1.5 mL三氯乙酸溶液（浓度50%）加入脱脂样品于5 mL离心管中，用去离子水定容（调节终浓度至最佳）。以10 000×g离心5 min，分离油脂沉淀，收集上清液，所得上清用环己烷萃取，去除中间杂质层继续萃取，直到界面清亮为一条线，收集水溶液，并称其质量。用氢化物原子荧光光谱法测定水溶液无机硒含量。

2 结果与讨论

2.1 硒标准工作曲线

按照仪器的最佳条件，确定硒的最佳线性范围0～25 μg/L，标准曲线方程为y=106.82x-29.84，曲线的相关系数R2=1，因此可利用此标准曲线测定鸡蛋中硒含量。按照仪器设定的检出限程序，经计算得出仪器检出限为0.002 μg/g。

2.2 所建方法的加样回收率与精密度

分别在蛋清和蛋黄中加入样品量80%，100%和120%的0.5 mg/L硒标准溶液，每组各测定3次共9次，计算加样回收率与精密度，蛋清加标无机硒样回收率为86.3%，RSD值为5.6%，可信度较高，证明所建方法通过15%三氯乙酸沉淀蛋白质及环己烷萃取对蛋清的分离方法较为可靠。蛋黄加标无机硒样回收率为81.6%大于80%，RSD值为4.4%（n=6），可信度较高，证明所建方法通过3%聚乙二醇除油脂、15%三氯乙酸沉淀蛋白质及环己烷萃取对蛋黄的分离方法较为可靠。

2.3 鸡蛋总硒测定及有机硒占比

通过氢化物原子荧光光谱法对蛋清蛋黄分别做3组平行，共6组数据测得鸡蛋不同部分总硒含量，结果如表1所示。通过对蛋清蛋黄分别进行分离处理，做3组平行，借助氢化物原子荧光光谱法测得无机硒含量，蛋清、蛋黄中无机硒的测定结果如表2所示。

由表1可知，蛋清、蛋黄总硒含量分别为0.073 561±0.003 49 μg/g和0.454 981±0.005 419 μg/g，鸡蛋内的硒主要存在于蛋黄，且蛋黄硒是蛋白硒的6倍以上。测定的RSD数值分别为0.64%和2.6%，说明所测数据可信度较高。

表1 鸡蛋各部分总硒含量

由表2可知，试验条件下，所测无机硒含量数据均为0，故RSD数值为0，原因可能是所取富硒鸡蛋无机硒含量较低无法检测出，由于氢化物原子荧光光谱法在称样量为1 g，定容体积为10 mL时，方法的检出限为0.002 μg/g，因而无机硒含量可能小于0.002 μg/g，此时蛋清中有机硒占比最少，约97.3%，蛋黄中有机硒占比最少，约99.6%。

表2 鸡蛋各部分无机硒含量

3 结论

建立测定鸡蛋中无机硒和有机硒的方法，蛋清通过三氯乙酸沉淀脱除蛋白，蛋黄通过聚乙二醇脱脂、三氯乙酸沉淀脱除蛋白后，经微波消解后可直接测定鸡蛋中无机硒和有机硒含量，线性范围在0～20 μg/g之间，无机硒检出限为0.002 μg/g，方法加样平均回收率在81.6%～86.3%之间，相对标准偏差（RSD，n=3）在0.64%～2.6%之间。该方法操作简单、灵敏度高、回收率好，适合富硒鸡蛋总硒和有机硒的测定。

结果表明，鸡蛋中的硒主要存在于蛋黄中，蛋黄中的硒含量约是蛋清中硒含量的6倍。通过3%聚乙二醇脱脂，15%三氯乙酸沉淀蛋白，实现有机硒与无机硒的有效分离，方法较为可信。