张芮娇，朱静静，刘绍芳，高斌，冯励

云南农业大学食品科学技术学院（昆明 650201）

竹虫又称为竹蛆，是螟蛾科（Pyralidae）禾草螟属（Chilo）的昆虫，竹虫的食用虫态为幼虫，主要分布于云南省的西双版纳州、德宏州、红河州等地区，是云南当地独具特色的民族食品昆虫[1-2]。

国内对竹虫的研究较少，关于竹虫蛋白的提取及其功能性质的研究鲜见报道。冯颖等对竹虫的营养进行分析，并且对其开发价值进行评述，分析表明，竹虫蛋白含量30%～40%，粗脂肪含量60.42%、氨基酸含量29.9%、不饱和脂肪酸含量55.9%，营养丰富[3]。国外较早对竹虫进行深入研究[4]，研究内容涉及生物学特性、滞育解除及生理生化等方面。

人类对昆虫蛋白资源的价值认识越来越深入，对其开发利用也逐渐重视，昆虫蛋白可能成为人类在21世纪重要的新蛋白资源，所以对竹虫蛋白的提取及研究具有重大意义[5-7]。试验通过碱提酸沉法提取竹虫蛋白，探究其功能性质，为竹虫蛋白的研究提供理论依据和试验基础，也为竹虫蛋白应用于保健食品及生物活性制剂等开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

竹虫（云南省西双版纳州市售）；氢氧化钠、盐酸、磷酸、浓硫酸硫酸铜、硫酸钾、硼酸、考马斯亮蓝等（昆明傲雪商务有限公司）。

SHZ-82恒温振荡器（金坛市大地自动化仪器厂）；UV-6100S紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；FD-1A-50冷冻干燥机（上海比朗仪器制造有限公司）；EPED-ESL-10TH实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 竹虫预处理工艺流程

竹虫洗净→液氮粉碎→自然风干→乙醚脱脂（1∶30）→自然风干→脱脂竹虫粉→密封保存备用

1.2.2 竹虫蛋白提取

1.2.2.1 工艺流程[8-9]

脱脂竹虫粉→碱法提取→离心（4 000 r/min，20 min）→酸沉（调pH至等电点）→静置→离心（4 000 r/min，20 min）→冷冻干燥→竹虫粗蛋白

1.2.2.2 蛋白提取方法

通过凯氏定氮法测定竹虫蛋白含量[10-14]。

式中：c为盐酸标准溶液浓度，mol/L；V1为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；V2为滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；m为样品质量，g；M为1/2 N2的摩尔质量，14.01 g/mol；F为氮换算为蛋白的系数。

利用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白含量[15]，蛋白质提取率计算如式（2）。

式中：M1为样品中蛋白含量，g；M0为提取液中蛋白含量，g。

以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程为：y=5.381 7x+0.111 3（R2=0.999 3）。

1.2.3 单因素试验设计

固定提取温度40 ℃、时间90 min、料液比1∶30 g/mL，考察不同浓度（0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mol/L）的NaOH溶液对竹虫蛋白提取率的影响；固定提取温度40 ℃，NaOH溶液浓度1.0 mol/L、料液比1∶30 g/mL，探讨不同提取时间（30，60，90，120和150 min）对竹虫蛋白提取率的影响；固定提取温度40 ℃、时间90 min、NaOH溶液浓度1.0 mol/L，探讨不同料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL）对蛋白提取率的影响；固定NaOH溶液浓度1.0 mol/L、时间90 min、料液比1∶30 g/mL，探讨不同提取温度（20，30，40，50和60 ℃）对竹虫蛋白提取率的影响。

1.2.4 竹虫蛋白的提取工艺优化

以单因素试验为基础，进行响应面试验设计，对竹虫蛋白的提取工艺进行优化[17-20]。优化分析因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计表

1.2.5 竹虫蛋白等电点的测定

将碱性的竹虫蛋白提取也调节至pH 3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0和5.2，静置2 h，在4 000 r/min条件下离心20 min后测提取液中蛋白的含量，提取液中所残留的蛋白含量最低时的pH即为蛋白的等电点。

1.2.6 竹虫蛋白功能性质的测定

参照参考文献，稍做修改，进行竹虫蛋白溶解度[21]、吸水性、吸油性、起泡性和起泡稳定性[22]，乳化及乳化稳定性的测定[23]。

1.3 数据处理

使用Excel 2010对试验数据进行统计分析及处理，利用Design-Expert 8.0.6进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 原料竹虫蛋白测定结果

采用凯氏定氮法，测得原料竹虫蛋白含量318 mg/g，蛋白含量达31.8%，结果与文献[1]中报道的含量基本一致。

2.2 竹虫蛋白等电点的测定

竹虫蛋白的等电点测试见图1。不同pH竹虫蛋白沉淀后，蛋白在pH 4.4时沉淀最多，上清液中蛋白残留率最低，说明竹虫蛋白的等电点为pH 4.4。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 NaOH溶液浓度对竹虫蛋白提取率的影响

不同NaOH溶液浓度对竹虫蛋白提取率的影响结果如图2所示。蛋白提取率随NaOH溶液浓度增加先呈上升趋势，NaOH溶液浓度达到1 mol/L时，蛋白提取率达到最高，为69.47%，而后呈现下降趋势。有研究表明，NaOH溶液浓度过高会使蛋白变性，导致蛋白提取率降低[24]。因此，选取NaOH溶液浓度1 mol/L。

图1 蛋白等电点的测定

图2 NaOH溶液浓度对蛋白提取率的影响

2.3.2 提取时间对竹虫蛋白提取率的影响

不同提取时间对竹虫蛋白提取率的影响结果如图3所示。蛋白的提取率随提取时间增加先呈上升趋势，提取时间达到60 min时，蛋白提取率达到最高，为69.86%，随着时间延长呈现下降趋势。因此，选取60 min为最优提取时间。

图3 提取时间对蛋白提取率的影响

2.3.3 料液比对竹虫蛋白提取率的影响

不同料液比对竹虫蛋白提取率的影响结果如图4所示。蛋白提取率随料液比增加先呈上升趋势，料液比为1∶30 g/mL时，蛋白提取率达到最高，为75.47%，随着料液比增加呈现下降趋势。因此，选取料液比1∶30 g/mL。

2.3.4 提取温度对竹虫蛋白提取率的影响

不同提取温度对竹虫蛋白提取率的影响结果如图5所示。

蛋白的提取率随提取温度的增加先呈上升趋势，提取温度达到50 ℃时，蛋白提取率达到最高，为74.11%，随着温度上升呈现下降趋势。因此，选取提取温度为50 ℃。

图4 料液比对蛋白提取率的影响

2.4 响应面优化与结果分析

2.4.1 响应优化及结果

竹虫蛋白提取率响应面分析的试验结果见表2。

表2 响应面分析试验结果

2.4.2 模型的建立及显著性的检验

通过对表2中的试验数据进行多项式拟合回归，得到竹虫蛋白的提取率与各变量的二次方程模型为：Y=63.3+7.55A+7.12B+4.65C+2.24D-1.07AB+2.37AC+2.3AD+1.38BC+2.08BD+0.21CD-3.79A2-1.02B2-1.59C2-4.17D2。

对回归方程进行方差分析，结果见表3。根据表3中的方差分析可知，模型的p＜0.000 1，表明该模型极显著，而失拟项的p=0.468 2＞0.05，失拟项不显著，并且模型的决定系数R2=0.99，信噪比Adeq precisior=41.59，说明模型与实际试验有较好拟合度，可信度较高，可用来预测和分析竹虫蛋白的提取工艺。离散系数C.V值为1.71%，C.V值越小，表示试验可信度越高。

从表3中可以看出，一次项A、B、C、D和二次项A2、B2、C2、D2，以及交互项AC、AD、BC、BD的p值均小于0.01，说明其对蛋白的提取率影响是极显著的；交互项AB、CD的p值均大于0.05，说明其对蛋白提取率的影响不显著。

表3 回归模型方差分析表

2.4.3 响应面优化结果

通过响应面的变化情况直观反各参数之间的交互作用对竹虫蛋白提取率的影响。

由图6可知，变量两两交互时，保持其中的两个变量不变，随着另外变量增加，竹虫蛋白提取率呈先上升趋势，当达到一定值时又呈下降趋势，综合响应面图由图6（a）、（b）可看出NaOH溶液浓度变化坡度更加陡峭，说明NaOH溶液浓度较料液比和温度对竹虫蛋白提取率的影响更显著；图6（c）可看出料液比变化的坡度更加陡峭，说明料液比较时间对竹虫蛋白提取率的影响更显著；图6（d）可看出蛋白提取率随时间变化的坡度更加陡峭，说明时间较温度对竹虫蛋白提取率的影响更显著，与方差分析结果相符。

2.4.4 最佳条件的确定和回归模型的验证

最佳条件的确定和回归模型的验证，结果见表4。

通过响应面分析得到竹虫蛋白提取率的最优工艺条件为：NaOH溶液浓度1 mol/L，时间60 min，料液比1∶31.67 g/mL，温度50 ℃。考虑实际操作情况与设备参数状况，确定竹虫蛋白提取率的最优工艺条件为：NaOH溶液浓度1 mol/L，时间60 min，料液比为1∶30 g/mL，温度为50 ℃。蛋白提取率预测值为77.45%。在最佳工艺条件下进行验证试验，得到蛋白提取率为76.14%，与理论结果接近，试验误差较小。

图6 提取率的交互作用

表4 最佳条件的确定和回归模型的验证

2.5 竹虫蛋白功能性质的测定结果

蛋白质制品在食品工业中可作为蛋白类添加剂等用于食品的开发和运用，其应用性能取决于其功能特性，试验对竹虫蛋白的溶解性、吸水性，吸油性，起泡性、乳化性等进行研究。研究表明竹虫蛋白在溶液5%、pH 7.0的中性条件下其功能性质最稳定[25]，测定结果如表5所示。

表5 竹虫蛋白功能性质测定结果

根据有关对不同蛋白的功能性质研究报道，从表5可以看出，竹虫蛋白的溶解度、吸水性、吸油性、起泡性和起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性均比较良好[26-27]，可利用其吸水性，吸油性等进行食品的开发及运用，将其作为一类蛋白质类添加剂，保证食品的口感和风味，对食品工业发展具有很大潜在价值。

3 结论

通过碱提酸沉法提取竹虫蛋白在响应面基础上，直观分析各因素对竹虫蛋白的提取率的影响及在提取过程中各因素的交互作用的影响。结果表明，各个提取条件对竹虫蛋白提取率的影响次序为：NaOH溶液浓度＞料液比＞时间＞温度。在1 mol/L NaOH溶液、料液比1∶30 g/mL、温度50 ℃、浸提60 min条件下得到竹虫蛋白的提取率为76.14%，此时竹虫蛋白的溶解度为23.11%±0.28%，吸水性为312.4%±0.8%，吸油性为372.27%±1.71%，起泡性为127.33%±3.06%，起泡稳定性为87.47%±1.25%，乳化性为52.87%±0.49%，乳化稳定性为35.37%±0.38%。说明竹虫具有潜在利用价值，对其进行开发利用，可带来较大的经济效益及社会效益。