崔艳，刘尚，邓琪缘，石磊，吕文*

1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津农产品加工工程技术中心（天津 300384）；2.天津市利民调料有限公司（天津 300308）

葡萄酒自然发酵是一个复杂的过程，是由酵母菌群相互作用触发的，发酵初期存在大量的非酿酒酵母，多来自葡萄园和葡萄皮，尤其葡萄汁有胞汉逊酵母和柠檬型克勒克酵母，可达到总菌的50%～70%，在较热地区有胞汉逊酵母占菌种的大多数[1]；发酵过程中随着酒精度的上升，酿酒酵母开始占主导地位，而非酿酒酵母因自身生长缓慢，再加上葡萄浆的渗透压、低pH、缺氧等抑制，数量快速下降甚至消失。近来研究发现发酵初期葡萄汁有胞汉逊酵母可氧化葡萄糖从而降低酒精度[2]，还可将碳元素从酒精代谢途径转移到其他的代谢产物中[3]。还发现非酿酒酵母具有葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白质水解酶和脲酶活性，生成的酯类、高级醇、甘油、醛类等物质可改善葡萄酒的风味[4]，其中有胞汉逊酵母具有很好的产乙酸酯的能力，是白葡萄酒的主要香气成分[5]。有试验用耐热克鲁维酵母和酿酒酵母混合发酵降低葡萄酒的酸含量[6]；用异常毕赤酵母和酿酒酵母混酿改善葡萄酒风味[7]；用法尔皮有孢汉生酵母和酿酒酵母增加乙酯含量，降低乙醇含量[8]；用美极梅奇酵母和酿酒酵母混酿降低普通葡萄酒的酒精度1.6%vol[9]。研究发现有胞汉逊酵母可被低含量SO2抑制，这一特点特别适用于低醇酒的酿造。但葡萄汁有胞汉逊酵母和酿酒酵母混酿低醇葡萄酒的研究仍鲜有报道。试验以天津汉沽（气候较热）的玫瑰香葡萄为原料，采用低温发酵，对葡萄汁有胞汉逊酵母和酿酒酵母进行混酿研究，以二者的接种时机和接种比例为变量，摸索其对低醇白葡萄酒品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

玫瑰香葡萄（天津汉沽区茶淀镇）；葡萄汁有孢汉逊酵母HU-3、酿酒酵母SC-6（实验室提供）。

1.2 方法

1.2.1 酿酒试验

新鲜葡萄榨汁，经调酸、果胶酶处理后灭菌。设定酵母菌总接种量为1.5×106CFU/mL，混酿组的接种比例为HU-3与SC-6 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和1∶2，接种时机为先接HU-3，12，24和36 h后分别接种SC-6，发酵温度16～18 ℃，目标酒精度6.5%vol，用6%的SO280 mg/L终止发酵。每12 h测发酵液糖度、OD值。以酿酒酵母（SC-6）和葡萄汁有胞汉逊酵母（HU-3）的纯培养分别为对照组1和对照组2。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 理化指标

酒精度、还原糖、总酸、挥发酸的测定，参见国标[10]。

1.2.2.2 感官指标

由10位专家组成感官评定小组，对所酿低醇白葡萄进行外观、香气、滋味和典型性的感官评价[10]。

1.2.2.3 香气成分的检测

顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）。

顶空固相微萃取：取10 mL酒样置于20 mL萃取瓶中，加入3.75 g氯化钠平衡30 min，以PDMS纤维头为萃取头，在45 ℃下萃取30 min，270 ℃解吸5 min。

色谱条件：N-NOWAX柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，程序升温：初始温度40℃，保持5 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持3 min。载气为氦气，流速1 mL/min，分流比50∶1。

质谱条件：EI离子源，电离电压70 eV；离子源温度230 ℃；电子倍增电压1 400 V。

1.2.2.4 数据处理

用Excel软件对数据进行统计分析，每个结果重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中的细胞生长曲线

由图1可知，对照组纯培养酿酒酵母生长速度最快，在60 h即达到低醇酒所需的糖度完成低醇酒发酵，OD值远高于其他组，但仍处于对数生长旺盛期。其次是纯培养的葡萄汁有胞汉逊酵母，60 h达到最大值后开始下降。HU-3与SC-6混酿组前24 h，4∶1组最高，其次为3∶1组，最低为1∶2组，24 h后，各混酿组生长速度出现差异，1∶2组逐渐加快，并保持最高生长趋势，60 h超过有胞汉逊酵母纯培养组继续上升，其他混酿组则趋于稳定甚至开始下降，但差距不大。结果表明混酿可明显降低发酵过程中及终止时的菌种数量，从而减轻终止发酵困难，尽管常规用量的SO2不足以完全致死对照组的酿酒酵母菌，但对混酿组的发酵终止可控。混酿组由于非酿酒酵母在前期能积累一些物质，会导致酵母菌的生长周期延长，这与前人研究一致[11]。接种间隔12 h时间太短，葡萄汁有胞汉逊酵母本身尚处于延迟期，自身生长缓慢，因此尽管比例不同混酿组间差距却没有拉开，可见接种时机对其生长是很重要的。

图1 2种菌间隔12 h接种时的细胞生长曲线

由图2知，24 h接种时，HU-3与SC-6混酿组更为分散，生长曲线基本位于2个纯培养对照组之间，且差距明显。24 h前混酿组均为4∶1组最高，1∶2组最低，有胞汉逊酵母数量越多，生长越快；36 h后酿酒酵母开始起酵，1∶1组和1∶2组明显快于其他组，除1∶2组以外，其余组OD值在60 h达到最大值，随后下降，其中2∶1组发酵完成时OD值在混酿中最低，这无疑对发酵的终止有好处。可见有胞汉逊酵母相对较多的组在60 h后均受到较高酒精度及其他条件的抑制，而酿酒酵母比例高的组则到达对数生长期，72 h时仍保持上升态势。说明在一定的接种时机下，接种比例对于发酵完成和终止具有显著影响。

图2 2种菌间隔24 h接种时的细胞生长曲线

由图3可知，HU-3与SC-6混酿组均在84 h才完成发酵，较前2个接种时机发酵时间长。前48 h混酿组均生长缓慢，48 h后，1∶2组明显发力，处于最高值，但由于前期有胞汉逊酵母生长时间较长，接种酿酒酵母后二者比例重排，使混酿组生长变化失去规律性。除了1∶1组和1∶2组在发酵完成时仍保持上升趋势，其余组酵母菌最大OD值均由前面的60 h推迟到72 h，终止时最低值为4∶1组。说明36 h的接种间隔延长酵母菌的生长周期，但缩短各比例组间差距，尽管周期延长可能会积累更多的代谢产物，但是发酵时间的延长却是实际生产不期望的。

图3 2种菌间隔36 h接种时的细胞生长曲线

2.2 发酵过程中的糖度变化

由图4可知，随着发酵时间延长，对照组酿酒酵母糖度下降最快，在24 h时开始快速下降，60 h达到终点，其次是有胞汉逊酵母组，但较酿酒酵母慢，而HU-3与SC-6混酿组均在48 h以后出现较明显下降，但各组降糖的速度和趋势很接近，更平缓，以1∶2组最先在72 h达到目标酒精度完成发酵。说明间隔12 h接种并没有比单纯有胞汉逊酵母更好地进行糖代谢，可能是时间太短，前24 h二者均处于延迟期，二者相互影响导致，36 h后1∶2组因为酿酒酵母含量高而降糖速度大于其他组，但差距并不太大。

图4 2种菌间隔12 h接种时的糖度变化

由图5可知，4∶1组在36 h前相对降糖较快，其次是3∶1组，最慢是1∶2组，规律性明显；36 h后，1∶2和1∶1组反超，在48 h后，HU-3与SC-6混酿组降糖速度均超过有胞汉逊酵母组。可能是因为接种酿酒酵母后该菌种快速起酵，和有胞汉逊酵母协同作用，在72 h完成发酵，说明顺序接种的间隔时机和接种的比例对降糖速度和发酵时间有影响。最终1∶2组糖度最低，其次是1∶1组，2∶1组，这和OD值变化一致，但是由于1∶1组和1∶2组最终的酵母数量过高，降糖虽然快，但是发酵终止相对困难，所以2∶1组更符合低醇酒获得稳定酒精度的要求。

图5 2种菌间隔24 h接种时的糖度变化

由图6可知，HU-3与SC-6混酿组在48 h时后出现下降趋势，但不如间隔24 h接种下降快，而前期速度均低于有胞汉逊酵母组；各混酿组在36～60 h出现降糖调整期，但由于顺序接种较晚，且酿酒酵母可能受到有胞汉逊酵母的代谢物抑制和延迟期的共同影响，且此时酿酒酵母数量不多，并没有起到主导作用，有胞汉逊酵母仍占大多数，因此这段时间的降糖作用并不显著，整体来看与有胞汉逊酵母对照组的糖度变化趋势和速度接近，到后期延长至84 h才降至目标糖度，明显不如间隔24 h接种，这在实际应用中是不利的。

图6 2种菌间隔36 h接种时的糖度变化

2.3 混酿低醇葡萄酒的理化指标

由表1可知，所有HU-3与SC-6混酿组最终酒精度均小于7%vol，符合低醇葡萄酒的酒精度国标要求，且酒精度均随着酿酒酵母比例升高而升高。2种菌接种间隔24 h时，混酿组酒精度均在目标酒精度6.5%vol左右，其中2∶1组为6.52%vol，而其他接种时机中，最接近目标酒精度的组分别是36 h的1∶2组和12 h的1∶2组，酒精度分别为6.41%vol和6.15%vol，其余组均低于6%vol，可见24 h不仅利于酒精度的稳定，并缩短发酵周期。说明混酿确实能降低酒精度，但酿酒酵母比例不能过高或过低，否则要么难以终止发酵或酒精度超标，要么不利于酒精的生成；还原糖结果与酒精度的结果具有对应关系，且过低或过高的糖会影响葡萄酒的口感，高糖更易染菌、出现产气现象而导致原酒不稳定，24 h，2∶1组糖度适中。总酸、混酿组和有胞汉逊酵母组均低于对照组，且有胞汉逊酵母比例越高酸越低，与前人的混酿降低葡萄酒酸度的报道一致，但接种时机的影响不明显，对于低醇酒来说，酸度和甜度相适宜为最好。挥发酸混酿组之间没有明显差别，均在合理范围之内。

2.4 感官评价

通过10位专家的感官评价，对照组1酒样在后期持续产生气泡，酒体浑浊，稳定性低，且有明显的硫味和酵母味；对照组2酒样尽管较澄清，但是酒香弱，口感偏甜，层次单薄；混酿组中第5组（2∶1、24 h）酒样在后期储藏过程中无气泡、无浑浊现象，酒体澄清透明，果香酒香协调，酸甜适宜，舒顺易饮，结构感好，有一定厚度，花香和果香较其他组明显，同时有较典型的葡萄品种香气，获得最高分92分。

表1 混酿低醇葡萄酒的理化指标

表2 混酿低醇葡萄酒的感官评价

2.5 香气成分分析

混酿酒样中高级醇异戊醇和苯乙醇含量明显下降，因为有胞汉逊酵母产该类高级醇的能力弱于酿酒酵母，对低醇酒有益。酯类中乙酸酯及乙基酯类物质含量较多，混酿酒样中乙酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸异戊酯的含量均明显高于对照组，其次辛酸乙酯，丁二酸二乙酯也高于对照组，其他酯类均相差不大，但是总酯含量大大增加。萜烯类物质，尽管多源于麝香葡萄本身，但有胞汉逊酵母具有产葡萄糖苷酶能力，可以降解葡萄汁中的萜烯醇-糖苷类物质，因此对单萜烯类物质有一定影响，试验中混酿组的萜烯类物质也高于对照组，但差距没有前人研究那么明显，可能是发酵时间较短，菌自溶和产酶作用不明显造成。

表3 混酿低醇葡萄酒的香气成分分析

3 结论与讨论

采用葡萄汁有胞汉逊酵母和酿酒酵母混合酿造低醇白葡萄酒，在接种有胞汉逊酵母24 h后再接种酿酒酵母，二者比例2∶1，总菌数1.5×106CFU/mL时，可获得酒精度为6%vol左右的，具有较高微生物稳定性和复杂香气的高品质新鲜型的低醇白葡萄酒。

与酿酒酵母纯培养相比，葡萄汁有胞汉逊酵母和酿酒酵母顺序接种的发酵方式，使葡萄酒的发酵过程变得可控，其发酵速度较慢[12]，发酵完成时的细胞总数较低，利于发酵的终止和原酒的稳定，同时二者的混合发酵产生更为丰富的代谢物，其相互作用改善酒中的香气和风味物质[13]，弥补低醇葡萄酒发酵时间短成分积累不足的缺陷，因此方式适用于低醇葡萄酒的酿造。