王国宏 盛海燕 代文静 蔡雅奇 张玉秋

（复旦大学脑科学研究院，医学神经生物学国家重点实验室，上海 200032）

躯体感觉系统对于调节机体对外界刺激的动态反应以及控制反射性及适应性行为具有重要作用，该系统在病理情况下的改变可以导致机体对外界的感知出现严重问题，如出现痛觉过敏、触诱发痛及触觉异常等[1～3]，这些病理性变化对病人的日常生活产生巨大的影响。因此，研究躯体感觉系统对外界刺激的感知及调控对于进一步开发临床治疗手段具有重要意义。躯体感觉依赖于初级感觉神经元到脊髓再到脑的信息传递，最终在大脑皮层对感觉及相关情绪的编码[4]。其中痛觉信息上行过程中，躯体感觉皮层编码了痛刺激的位置与强度信息，而扣带皮层、岛叶皮层等脑区参与编码痛刺激的情绪成分[2,5]。同时，部分皮层脑区，如前扣带皮层、前额叶皮层等还通过由上而下的投射参与躯体感觉及痛觉处理的下行调控[6～8]。以上研究表明，躯体感觉信息的上行传递及下行控制都离不开大脑高级中枢的精细调控。然而，以往的研究更多地关注了躯体感觉调控在外周感受器和脊髓水平的机制，对于皮层功能的关注相对较少[9,10]。

初级躯体感觉皮层 (primary somatosensory cortex, S1) 在接受躯体感觉信息、定位及描述痛觉感觉维度信息的过程中起到重要作用[4,11,12]。有研究显示，慢性痛情况下S1 脑区活性发生改变，并直接贡献于触诱发痛的产生和其他痛相关脑区的可塑性变化[13,14]。直接调控S1 神经振荡可以引起小鼠躯体感觉的变化[15]。进一步的研究也证明S1 脑区可通过皮质脊髓投射影响神经病理性痛的触觉异常[4]。基于以上证据我们推测，S1 可能直接影响躯体感觉过程，但具体的影响及其机制还有待探索。为此，本研究利用Tra2b (Sfrs10)条件性敲除建立的皮层缺失动物模型[16,20]及化学遗传学调控技术，探究了小鼠整体皮层缺失和S1 脑区抑制对躯体感觉相关行为反应的影响，并进一步探索了可能的环路机制，以期为更深入地了解皮层脑区对躯体感觉的调控作用提供新的线索。

方 法

1.实验动物及分组

本研究使用的皮层缺失小鼠由Emx1-Cre 小鼠（JAX#005628，复旦大学张嘉漪教授赠予）与Tra2bflox/flox小鼠（University of Cologne, Germany，德国科隆大学Brunhilde Wirth 教授赠予）交配繁殖所得，野生型C57BL/6J 小鼠购买于中科院上海实验动物中心。实验小鼠鼠龄均为8～12 周，饲养于12 h/12 h 人工昼夜节律环境中，自由摄食和饮水。所有实验行为严格遵照国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain, IASP)的痛觉研究相关规定，并获得复旦大学实验动物中心动物保护和使用委员会及动物伦理委员会批准。

实验分组：①研究皮层缺失对动物痛觉及触觉的影响，将Tra2bfl/fl，Emx1-Cre 皮层缺失 (Cortexless) 小鼠分为皮层缺失组，将Tra2bfl/+，Emx1-Cre 同笼杂合子小鼠作为对照组；②研究化学遗传学抑制初级躯体感觉皮层下肢代表区 (primary somatosensory cortex, hindlimb region, S1HL) 对动物痛觉及触觉的影响，将动物分为溶剂对照组和实验处理组。

2.仪器设备

von Frey 纤毛（美国Stoelting 公司）、Hargreaves 热辐射测痛仪（美国IITC life science 公司）、Brush 刷毛（上海金泥美术用品公司）、圆形粘纸（美国Diversified Biotech 公司）、小鼠脑立体定位注射仪 （美国Stoelting 公司）、振动切片机（德国Leica 公司）、冰冻切片机（德国Leica 公司）、VS120 荧光显微镜（日本Olympus 公司）。

3.主要试剂

Clozapine N-oxide (CNO)（美国Sigma 公司），以生理盐水配置浓度为1 mg/ml 备用；AAV-hSyn-HA-hM4D(Gi)-mCherry 病毒（上海和元生物）；AAV-hSyn-Synaptophysin-mRuby-T2A-mGFP 病毒（上海泰儿图生物）。

4.实验方法

（1）von Frey 测试：将小鼠放置于及金属网制成的测试台上，适应30 min。适应结束后，使用von Frey 纤毛以从低到高的顺序（0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1 和1.4 g）垂直刺激小鼠后足足底中部，保证刺激时纤毛持续弯曲至少2 s，每只小鼠使用相同强度纤毛刺激5 次，记录每次刺激时小鼠的行为表现，出现痛相关行为反应（缩足、甩腿、舔舐、抬腿等）则记为阳性反应，出现3 次阳性反应的最低刺激强度则记为该小鼠机械痛阈值。

（2）Hargreaves' 辐射热测试：测试前将动物放置在辐射热测试台并用有机玻璃盒限制其活动，适应30 min。设定测试仪刺激强度，待小鼠处于静息状态时，依次刺激每只被测小鼠后足足底中部皮肤，记录小鼠出现痛相关行为反应的阈值。每只小鼠测试5 次，将每次测试时的反应阈值求平均值后作为该小鼠的辐射热阈值。

（3）轻毛刷测试：将小鼠放置于金属网测试台上并适应30 min。适应后待小鼠处于平静状态时，使用软毛刷刷头中部，轻轻从小鼠足底踝部向足底趾部轻刷，避免直接用毛刷戳小鼠足底，同时记录动物行为反应类型。测试时每只小鼠轻刷10 次，每次间隔2 min 以上，统计小鼠出现走开或抬足等行为反应的次数作为毛刷测试的结果。

（4）贴纸去除测试：将待测小鼠放置在透明玻璃板上，限制于有机玻璃盒(20 cm×10 cm×20 cm)中适应30 min。测试时将一直径5 mm 的圆形贴纸黏贴在小鼠后足足底皮肤中部，允许小鼠在盒中自由活动，记录小鼠首次咬或舔足底试图去除贴纸的潜伏期，以此为贴纸去除测试的阈值。

（5）脑立体定位微注射病毒和化学遗传学操控：小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液(50 mg/kg)麻醉后，固定于小鼠脑立体定位仪，沿头部中线剪开皮肤并暴露颅骨前囟及后囟，调整颅骨前囟及后囟在同一平面后，依照小鼠脑定位图谱确定注射脑区位点(S1HL AP:-0.45 mm; ML:±1.5 mm; DV:-1.25 mm)，用颅骨钻在颅骨上开孔，使用纳升注射泵将病毒注射于目标脑区，注射完成后缝合皮肤，待小鼠恢复4 周后进行行为学实验。

为研究初级躯体感觉皮层在小鼠触觉及痛觉信息处理中的作用，在该脑区注射了神经元靶向的AAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry 病毒 (2.66×1013V.G./ml, 300 nl/per side)。各类行为学实验在病毒表达 4 周后进行，测试前30 min 通过腹腔注射的方法给予氯氮平N-氧化物(Clozapine N-oxide, CNO, 5 mg/kg) 激活hM4D(Gi)受体抑制该脑区神经元活动。溶剂对照为等体积的生理盐水。

（6）脑片准备和全细胞膜片钳记录：小鼠腹腔注射25% 乌拉坦溶液(1.5 g/kg)过量麻醉后，迅速经左心室灌流预先准备的冷切片液20 ml 并断头取脑。切片液成分包括（浓度mM）：92 NMDG（N-甲基-D-葡萄糖）、2.5 KCl（氯化钾）、1.2 NaH2PO4（磷酸二氢钠）、20 HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）、30 NaHCO3（碳酸氢钠）、25 glucose（葡萄糖）、5 Na-ascorbate（抗坏血酸钠）、3 Na-pyruvate（丙酮酸钠）、2 thiourea（硫脲）、10 MgSO4（硫酸镁）、0.5 CaCl2（氯化钙）。使用振动切片机(Leica, VT1200S)切取S1HL 脑区所在位置的脑片（厚度350 mm），并转移至通入混合气(95% O2, 5% CO2)的人工脑脊液(ACSF)中孵育。ACSF 成分包括（浓度 mM）：19 NaCl（氯化钠）、2.3 KCl（氯化钾）、1 NaH2PO4（磷酸二氢钠）、26.2 NaHCO3（碳酸氢钠）、12 glucose（葡萄糖）、1.3 MgSO4（硫酸镁）、2.5 CaCl2（氯化钙）。

在进行化学遗传学生物学效能验证时，采用全细胞记录模式，将放大器调至电流钳。成功转染hM4D(Gi)-mCherry 病毒的神经元带有红色荧光，记录带有红色荧光且存在自发放电的S1HL 神经元，以gap-free 模式记录该神经元动作电位，稳定记录5 min 后，向灌流液中加入CNO (500 nM)，动作电位发放逐渐减少甚至消失，再用ACSF 冲洗灌流系统，神经元动作电位发放逐步恢复。

（7）在体电生理记录：小鼠腹腔注射25%乌拉坦溶液(40 mg/kg)麻醉后，进行气管插管。剪开背部皮肤去除T13、L1椎骨暴露脊髓，同时剪开小鼠左侧大腿皮肤暴露坐骨神经。将手术后的小鼠转移至电生理记录平台，维持体温在37±0.5℃，使用液体石蜡保持脊髓和坐骨神经的湿润。将记录电极插入脊髓中央血管左侧1～2 mm 处，深度100～300 μm，记录基线的刺激强度为0.3～0.6 mA，波宽0.5 ms，每两次刺激间隔为60 s。记录到的脊髓背角场电位经电信号放大器进入数模转换器(micro1401mkII, CED)转换成数字信号，并由信号采集软件(spike2, CED)记录保存。

（8）顺向示踪S1HL 下行投射脑区：通过立体定位注射技术向双侧S1HL 注射顺行示踪病毒AAV-hSyn-Synaptophysin-mRuby-T2A-mGFP (1.77×1013V.G./ml, 300 nl/per side)，病毒注射4 周后对小鼠进行灌流取脑。固定脱水完全的脑组织包埋后进行冰冻切片，切片厚度30 μm，取导水管周围灰质(periaqueductal grey, PAG)和延髓头端腹内侧部(rostral ventromedial medulla, RVM)所在脑区的切片，孵育DAPI (1:5000)标记细胞核。封片后在荧光显微镜下进行观察，S1HL 病毒注射区显示GFP绿色荧光，S1HL 投射神经元的轴突末梢，即接受S1HL 投射的脑区，显示Ruby 红色荧光。

5.统计学分析

实验数据以均数+标准误(x±SEM)表示。采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，组间数据比较分析采用双尾非配对t 检验(two-tailed Student's t-test)或双因素方差分析 (two-way ANOVA)， P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1.皮层缺失导致触觉敏化

可变剪切因子亚型2β (Tra2b) 参与哺乳动物包括神经发育在内的多种组织发育过程，本实验利用Tra2bflox/flox小鼠与Emx1-Cre 小鼠交配建立Tra2b 条件敲除小鼠以作为皮层缺失动物模型, 研究皮层缺失对小鼠痛觉及触觉的影响。如图1 所示，基因型表达为Tra2bfl/fl；Emx1-Cre 的条件敲除 (cKO) 小鼠成年后大部分皮层脑区及海马缺失，仅吻侧及外侧部分皮层组织残存，为皮层缺失组 (Cortexless)；而基因型表达为Tra2bfl/+；Emx1-Cre 的小鼠大脑皮层发育正常，皮层及海马结构与野生型小鼠无异，实验中作为对照组(Control)。

为研究皮层缺失对小鼠痛觉的影响，接下来的行为学实验中，比较了皮层缺失组小鼠辐射热痛阈和机械痛阈与对照组的差异，研究发现两组小鼠热痛阈（见图2A，two-tailed Student's t-test: t(11)= 0.53,P = 0.61）和机械痛阈（见图2B，two-tailed Student's t-test: t(12)= 0.47, P = 0.65）均无明显差异；进一步分析小鼠对不同强度机械刺激的反应频率，发现皮层缺失组与对照组之间的差异也无统计学意义（见图2C，two-way ANOVA: F(1,13)= 3.14, P = 0.08）。以上结果说明Tra2b cKO 引起的皮层缺失不影响小鼠的痛阈值。

图1 皮层缺失小鼠及其对照小鼠的脑结构 (A)成年对照小鼠头部及脑结构；(B) 成年皮层缺失小鼠头部及脑结构；(C) 对照小鼠脑部冠状切片，标尺= 2 mm；(D) 皮层缺失小鼠脑部冠状切片，标尺= 2 mmFig.1 Brain structures of cortexless and control mice (A) Whole-mount brain structure and sagittal view for head of adult control mice; (B) Whole-mount brain structure and sagittal view for head of adult cortexless mice; (C) Coronal brain sections of control mice, Scale bar = 2 mm; (D) Coronal brain sections of cortexless mice, Scale bar = 2 mm.

本研究进一步测试了皮层缺失对小鼠触觉感知的影响，轻毛刷测试结果显示皮层缺失组相比对照组出现了更多的走开或抬足反应（见图2D，twotailed Student's t-test: t(20)= 2.51，P = 0.02）； 在另一种检测动物触觉敏感度的贴纸去除实验中，皮层缺失组也表现出更高的触觉敏感度，其对足底贴纸做出反应的潜伏期明显短于对照组（见图2E，twotailed Student's t-test: t(12)= 4.76, P = 0.0005）。说明皮层缺失增强了小鼠对触觉感知的敏感性。脊髓在体电生理记录实验也进一步验证了这一结果。如图2F所示，皮层缺失组小鼠脊髓Aβ 纤维（传递触觉信息）诱导的场电位幅度明显大于对照组，且呈现强度依赖性(two-way ANOVA: F(1,4)= 184.70, P ＜ 0.0001)。

2.抑制S1HL 神经元引起触觉敏化和触诱发痛

图2 皮层缺失对小鼠痛觉和触觉的影响 (x±SEM) (A) 辐射热痛阈测定 (n = 7)；(B) 机械痛阈测定 (n = 7)；(C) 机械敏感度测定 (n = 7)；(D) 轻毛刷测试的反应次数 (n = 11)；(E) 贴纸去除潜伏期 (n = 7)；(F) 脊髓在体电生理记录Aβ 纤维诱导场电位 (n = 3) *P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001, Student's t-test，与对照组相比； ###P ＜ 0.001, ####P ＜ 0.0001, Two way ANOVA，与对照组相比Fig.2 The effects of cortex deficiency in pain and touch (x±SEM) (A) Thermal pain threshold (n = 7); (B) Mechanical pain threshold (n = 7); (C) Mechanical sensitivity test(n = 7); (D) Responses of light brush (n = 11); (E) Latency of adhesive removal (n = 7); (F) Aβ fiber evoked filed potential (n = 3) *P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001, Student's t-test, compared with group control; ###P ＜ 0.001, ####P ＜ 0.0001, Two way ANOVA, compared with group control.

为进一步探究皮层缺失对痛觉和触觉的影响是否与初级躯体感觉皮层相关，本研究在小鼠初级躯体感觉皮层下肢代表区 (S1HL) 微量注射AAVhSyn-hM4D(Gi)-mCherry 病毒，待病毒注射4 周后，通过腹腔注射DREADD 受体的外源性的配体CNO (5 mg/kg)激活Gi 信号，观察广泛抑制S1HL神经元对小鼠痛觉及触觉的影响（见图3A）。全细胞膜片钳记录显示，表达hM4D(Gi)-mCherry 的神经元在给予CNO 灌流后，动作电位发放被抑制，洗脱后，逐渐恢复（见图3B），表明化学遗传学操控成功抑制S1HL 神经元活动。在行为学实验中观察到相比溶剂 (Vehicle) 对照组，CNO 组小鼠辐射热痛阈无明显变化（见图3C，two-tailed Student's t-test: t(10)= 1.83, P = 0.10），但机械痛阈明显下降（见图3D，two-tailed Student's t-test: t(10)= 7.42, P ＜ 0.0001），对不同强度机械刺激的敏感性显著增强（见图3E，two-way ANOVA: F(1,10)= 58.44, P ＜ 0.0001），呈现出明显的触诱发痛。轻毛刷测试和贴纸去除测试结果显示，CNO 组对轻毛刷的反应次数相比对照组显著上升（见图3F，two-tailed Student's t-test: t(8)= 3.43, P = 0.01），贴纸反应潜伏期下降趋势明显，尽管未达统计学意义（见图3G，two-tailed Student's t-test: t(8)= 2.21, P = 0.058）。以上实验结果提示，S1HL脑区参与对触觉及触诱发痛的调控。

3. S1HL 到PAG 和RVM 的下行投射

根据先前的结果，皮层缺失和S1HL 广泛抑制都会影响小鼠机械感觉，但是这部分皮层区域通过何种途径调控机械感觉还有待进一步探索。为此，本研究在S1HL 脑区注射了顺行示踪病毒AAV-hSyn-Synaptophysin-mRuby-T2A-mGFP（见图4A），该病毒将荧光蛋白与特定表达于突触前的突触素(synaptophysin) 蛋白偶联，可以在突触前表达红色荧光蛋白，从而标记病毒注射的S1HL 脑区与其他脑区形成突触连接的轴突末梢位置，以寻找S1HL 潜在的下游脑区。病毒注射四周后，通过组织切片观察，发现RVM 存在S1HL 投射的突触末梢，说明该脑区接受S1HL 投射并形成突触联系（见图4B）。同时在PAG 也发现了大量投射末梢的分布，说明PAG 也接受大量S1HL 投射并与这部分投射神经元形成突触联系（见图4C）。鉴于RVM 及PAG 广泛参与多种感觉的下行调控，以上结果表明S1HL 脑区与参与机体感觉下行调控的部分脑区之间形成了一定神经环路联系。

图3 化学遗传学抑制S1HL 对躯体感觉的影响(x±SEM) (A)病毒注射位点和实验流程图，标尺= 1 mm；(B) 1 例AAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry 病毒注射脑区神经元在CNO孵育后，动作电位发放被完全抑制，洗脱后可逐渐恢复； (C) 辐射热痛阈测定 (n = 6)；(D)机械痛阈测定 (n = 6)；(E) 机械敏感度测定(n = 6)；(F) 轻毛刷测试 (n = 5)；(G) 贴纸去除测试 (n = 5) **P ＜ 0.01, ****P ＜ 0.0001, Student's t-test，与溶剂组相比；#P ＜ 0.05, ###P ＜ 0.001, ###P ＜ 0.0001, Two way ANOVA，与溶剂组相比 Fig.3 The effects of S1HL functional inhibition in somatosensory system (x±SEM) (A) Viral injection site and experimental procedure, Scale bar = 1 mm; (B) An example showing that bath CNO (500 nM) inhibits action potential firing in S1HL neuron from AAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry injection mouse; (C) Thermal pain thresholod (n = 6); (D) Mechanical threshold (n = 6); (E) Mechanical pain sensitivity test (n = 6); (F) Responses of light brush (n = 5); (G) Latency of adhesive removal (n = 5) **P ＜ 0.01, ****P ＜ 0.0001, Student's t-test, compared with group vehicle; #P ＜ 0.05, ###P ＜ 0.001, ###P ＜ 0.0001, Two way ANOVA, compared with group vehicle.

讨 论

一般认为在痛觉信息上传过程中，躯体感觉皮层编码了痛刺激的位置与强度信息，而前扣带皮层、岛叶皮层等脑区参与编码痛刺激的情绪成分[2]。同时，部分皮层脑区如前扣带皮层和前额叶皮层等还通过由上而下的投射参与对躯体感觉和痛觉信息处理的下行调控[17,18]。这些研究提示我们皮层区域对于调控躯体感觉具有重要作用。在此基础上，本研究利用转基因动物模型及化学遗传学操控技术进一步探究了部分皮层脑区对触觉及痛觉感知的影响。

研究中首先采用Tra2b 条件敲除建立了皮层缺失动物模型，然后利用Hargreaves、von Frey 测试方法检测了皮层缺失小鼠的基础痛阈，发现皮层缺失不影响小鼠热痛阈及机械痛阈。而进一步检测小鼠的触觉反应，发现皮层缺失可导致小鼠触觉感知明显增强，导致动物触觉敏化。这些结果说明，在该模型中皮层缺失更多影响动物对非伤害性触觉刺激而不是伤害性痛觉刺激的感知，提示皮层脑区对触觉信息处理的调控在皮层缺失后受到显著影响。鉴于条件敲除Tra2b 导致的皮层缺失源于对小鼠正常神经发育过程的影响[19,20]，在皮层缺失小鼠发育过程中，部分缺失脑区原有功能有可能被存留的其他脑区所代偿，而不能准确反映成年小鼠皮层的功能。因此需要在成年小鼠更精准的定位调控具体的皮层脑区，以确定其对躯体感觉的影响。

图4 S1HL下行投射脑区 (A) 病毒注射位点，标尺= 1 mm；(B) 延髓头端腹内侧部 (RVM) 接受S1HL 投射，标尺= 500 μm；(C) 向脑干导水管周围灰质(PAG)接受S1HL 投射 标尺= 500 μmFig.4 Tracing the projection of the S1HL (A) Injection site of virus, Scale bar = 1 mm; (B) Rostral ventromedial medulla (RVM) receives projection from S1HL, Scale bar = 500 μm; (C) Periaqueductal grey (PAG) receives projection from S1HL, Scale bar = 500 μm.

初级躯体感觉皮层 (S1) 广泛参与躯体感觉和对伤害性刺激的定位和辨别，有部分研究指出S1 还参与对慢性痛触觉异常的调控[4,13,14]。因此在本研究中，我们利用化学遗传学手段进一步检测了正常生理条件下，抑制该脑区神经元活动对躯体感觉的影响。结果显示，化学遗传学广泛抑制S1HL 神经元活性不影响辐射热痛阈，但小鼠机械痛阈在抑制后明显下降，对不同强度机械刺激的敏感度明显上升。在非痛触觉实验中，抑制S1HL 同样增强了小鼠的触觉反应，引起触觉敏化。这些结果说明S1HL 在正常生理情况下参与躯体感觉，特别是触觉相关感觉。抑制S1HL 可直接导致动物触觉敏化并产生触诱发痛，提示S1HL 脑区对小鼠下肢触觉和机械痛觉反应至关重要。

而为了探索S1HL 调控躯体感觉的下行通路，我们采用病毒示踪技术追踪了S1HL 神经元投射末梢定位，发现S1HL 神经元有向脑干PAG 和RVM脑区的广泛投射。根据以往文献报道，PAG 和RVM 是痛觉下行抑制系统的重要核团。其中PAG被证明参与多种复杂行为的调控，特别是内源性阿片镇痛系统的主要参与者[7,21,22]；而RVM 即接受来自PAG 的下行投射也可被部分皮层等高级脑中枢调控，进而抑制或易化疼痛感受[6]。Francois 等研究发现RVM 内GABA 神经元可通过下行至脊髓的环路直接易化机械痛觉[23]，这与本研究抑制S1HL 的实验结果高度相似。结合以上研究和本实验的结果，推测抑制S1HL 可能影响PAG 和RVM 等参与机体感觉下行调控的脑区，进而提高动物对机械刺激的敏感程度，导致触觉敏化和触诱发痛。

综上所述，本研究发现皮层缺失影响小鼠触觉敏感性，抑制S1HL 神经元导致小鼠触诱发痛和触觉敏化，该作用可能通过内源性痛觉下行调控系统实现。本研究为进一步理解皮层脑区对躯体感觉的调控提供了证据，为更加深入地研究这种调控机制以及为慢性痛的治疗提供了线索。