李伟慇

自噬是亚细胞膜结构发生动态变化并经溶酶体介导对细胞内蛋白质和细胞器降解的过程。通过平衡细胞合成和分解代谢,自噬稳定细胞内环境,维持细胞存活。据有关研究,自噬于心肌缺血期和再灌注期起不同作用,缺血初期主要有保护作用,而再灌注期则做成细胞损伤而致死亡。40 多年前,就有关于缺血再灌注后自噬体诱导产生的报道［1］。模拟状态一过性缺血再灌注可引起自噬泡增加。通过增强自噬作用,胎鼠心脏在无糖培养液中可长达4 h 无损伤。Decker 等［2］发现,离体灌流兔心后再灌注能引起显著的自噬作用及心功能的恢复,而激起细胞修复过程。上述实验均证明急性心肌缺血过程中存在自噬,且自噬泡产生与之后心肌功能的恢复是互随的。但另有研究指出,缺血再灌注过程中的自噬作用,有不利心肌细胞存活的作用,特别在再灌注过程中。通过3-MA 阻断饥饿诱导的自噬在H9C2 转化心肌细胞中,能够降低细胞死亡［3］。因此本课题旨在探讨自噬作用增强对缺氧引起的H9C2心肌细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 电子天平为瑞士Mettler Toledo 生产的AL104 电子天平,超净台由苏州净化生产,中型冷冻台式离心机Universal 32R Hettich zentrifugen 来自德国Hettich,移液器为德国Eppendorf 制造。MTT：Costar 48孔细胞培养板采用美国CORNING-COSTAR,日本Sanyo细胞培养箱,酶标仪为Labsystems Dragon 的Wellscan MK3 台盼蓝染色：Corning 细胞培养皿为美国Corning生产,显微镜为日本Olympus CKX41-A32FL/PH 倒置显微镜。

1.1.2 药品与试剂 DMEM 培养基与0.25%胰蛋白酶均为美国gibco 的产品,磷酸缓冲盐溶液(PBS)为武汉博士德生物工程有限公司生产,Rapamycin 购于美国Sigma。MTT：凯基生物生产的MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒KGA311。台盼蓝染色：曲利本兰购自广州瑞舒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养 待H9C2 心肌细胞密度接近90%进行传代：弃瓶中原液,用PBS 液清洗细胞表面2 次,加0.25%的胰蛋白酶消化液(含EDTA),令消化液恰好覆盖细胞表面,入37℃CO2孵箱中消化1 min 左右,倒置于显微镜下见细胞成片收缩变圆、边界清楚时,即加入含10%FBS 的DMEM 培养液终止消化,并反复轻轻吹打瓶底,使细胞脱壁,把细胞悬液移入离心管,1100 r/min 离心10 min,弃上清,加入含有10%FBS 的DMEM 培养液重悬细胞。镜下计数,以1∶3 左右比例分装接种于新培养瓶中,静置于37℃的CO2孵育箱中。24 h 后可见细胞重新贴壁生长,换新鲜培养基以去除组织块与死细胞。

1.2.2 实验分组 本次试验用H9C2 转化心肌细胞来模拟乳鼠心肌细胞,造模：乳鼠心肌细胞。分为Con组(正常培养12 h),C-R1组(正常培养12 h+1 mM rapamycin),C-R10组(正常培养12 h+10 mM rapamycin),C-R100组(正常培养12 h+100 mM rapamycin),C-R1000组(正常培养12 h+1000 mM rapamycin),N组(缺氧12 h),N-R1组(缺氧12 h+1 mM rapamycin),N-R10组(缺 氧12 h+10 mM rapamycin),N-R100组(缺氧12 h+100 mM rapamycin),N-R1000组(缺氧12 h+1000 mM rapamycin)。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 MTT 在96 孔板加入细胞100 μl/孔(约1×104),置37℃ 5% CO2细胞培养箱培养。然后待细胞密度适合后将需要缺氧的96 孔板放进1% O2细胞培养箱培养12 h。将5×MTT 用 Dilution Buffer 稀释成1×MTT。每孔加100 μl 1× MTT,37℃孵育4 h,令MTT还原为甲臜。吸出上清液,每孔加150 μl DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀后即可用酶标仪在560 nm波长处检测每孔的光密度。然后分析细胞存活率,具体方法为将各测试孔的光密度(OD)值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取均数±标准偏差。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率=(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。

1.2.3.2 台盼蓝染色 配制4%台盼蓝母液：称取4 g台盼蓝,加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100 ml,用滤纸过滤,4℃保存。使用时,用PBS 稀释至0.4%。然后胰酶消化贴壁细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释。细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1 混合混匀。(终浓度0.04%)在3 min 内,分别计数活细胞和死细胞。镜下观察,死细胞被染成明显的蓝色,而活细胞拒染呈无色透明状。统计细胞活力：活细胞率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.3 观察指标 分析MTT、台盼蓝染色细胞存活率。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 5.0 统计软件处理,存活率采用单因素方差分析(ANOVA),组间比较用LSD 法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 细胞存活率分析 正常处理的Con组与C-R10组,C-R100组的存活率比较,差异有统计学意义(P＜0.05),缺氧处理中N-R100组存活率最高,为0.068%。见表1,图1,图2。

图1 正常处理

图2 缺氧无糖12 h

2.2 台盼蓝染色细胞存活率分析 Con组、C-R1组、C-R10组、C-R100组、C-R1000组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。N组、N-R1组、N-R10组、N-R100组、N-R1000组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05),其中N-R100组存活率最高,为0.058%,与MTT 结果基本吻合。见表2,图3,图4。

表2 台盼蓝染色细胞存活率分析(%)

图3 正常处理

图4 缺氧无糖12 h

3 讨论

细胞在基础状态下自噬水平较低,用于维持内环境的稳态；但是当细胞处于营养或能量不足、结构重建以及清除损坏的细胞器等状态时自噬被显著激活。从信号调控机制分类自噬的信号途径分为两种,其中一种是哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依赖性途径,mTOR 是细胞中ATP 和氨基酸等营养物质的感受器,是细胞自噬的重要调节者。mTOR 的活性受细胞中葡萄糖与氨基酸水平的调节。当细胞中营养充足时,胰岛素与受体结合后,通过激活ClassⅠPI3KPI3K-AKT激酶信号通路,继而活化蛋白激酶mTOR。mTOR 通过抑制自噬相关蛋白Atg1-Atg13 复合物的形成来抑制细胞自噬的发生；当处于饥饿时,mTOR 的活性被抑制,导致Atg 家族成员活化,促进自噬泡的形成。而本次实验用rapamycin 正是通过抑制mTOR 活性而刺激自噬。由结果可知,通过适量的rapamycin 适度刺激自噬作用发生对缺氧心肌细胞有一定的保护作用。这可能是因为细胞营养不足时,自噬途径被激活,诱导自噬体形成,并由溶酶体介导降解膜磷脂及胞质内蛋白质等,给细胞提供能量与维持细胞的主要合成代谢。因此它可抑制慢性缺氧导致的凋亡,降低缺氧性心肌损伤,是缺氧过程心肌细胞自我保护的一种机制［4-6］。

综上所述,本实验利用H9C2 转化心肌细胞来模拟乳鼠心肌细胞,采用MTT 与台盼蓝染色来检查细胞活力,研究自噬增强对缺氧引起的心肌细胞活性的影响。通过本课题的研究可以得出以下结论：适当的自噬增强可保护缺氧引起的心肌细胞损伤。