王 强， 孟艳秋

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是一种五环三萜类化合物，在自然界中分布广泛，主要以游离或与糖结合成糖苷的形式存在.OA具有广泛的生物活性，如护肝、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤等[1-4].OA结构中可供修饰的位点有限，研究主要集中在A环、C环、C-3和C-28位，对其他位点进行改造的报道不多.目前，Honda等[5-6]发现了化合物1(化合物1～3的结构见图1)是OA研究领域的一个重大突破，其具有极强的抗肿瘤活性.化合物2和化合物3等均表现出显著增强的抗肿瘤活性，并且能够作用于细胞内多条信号转导通路，是迄今为止抗肿瘤活性最强的半合成三萜化合物[5-7].因此，化合物1的结构优化也成为当前的研究热点.WIEMANN等[8]对OA的C-3位羟基和C-28位羧基进行了结构修饰，合成的氧肟酸衍生物较OA抗肿瘤活性有了显著增强.另有研究发现[9-11]，将C-28位羧基改造成酯或酰胺，对提高OA的抗肿瘤活性有利.

图1 化合物1～3的结构

本文结合前期OA结构改造的经验[12-13]，将A环C-2，3位改造成酮肟基，形成新型A环结构，同时C-28位羧基进行成酯或酰胺化，设计合成了两类共10个新型OA衍生物.合成路线见图2.

试剂和条件：a 丙酮，琼斯试剂，室温 b 二甲基甲酰胺，无水碳酸钾，溴代烷 c 叔丁醇，叔丁醇钾，50 ℃ d 盐酸羟胺，无水吡啶 e 二氯甲烷，草酰氯，二甲基甲酰胺，室温 f 苯酰胺，三乙胺，室温

1 实验部分

1.1 化学合成

1.1.1 3-氧代-齐墩果烷型-12-烯-28-羧酸的制备(OA-1)

OA(0.500 g，1.10 mmol) 溶解于50 mL丙酮溶液中，冰浴条件下缓慢滴加配制的新鲜Jones 试剂(0.64 mL，5.78 mmol)，常温反应2 h后，加入异丙醇(15 mL)，常温反应0.5 h.水洗，无水硫酸镁干燥，减压抽滤，蒸发溶剂.粗品分离纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]，得白色固体OA-1(0.470 g，质量分数为95 %).

中间体OA-1(0.470 g，1.05 mmol) 溶解于DMF(20 mL)，加入碳酸钾(0.3g) 和溴乙烷[n(OA-1)∶n(溴乙烷)=1∶5]，常温反应5 h.过滤，水洗，无水硫酸镁干燥，减压抽滤，蒸发溶剂.粗品分离纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=50/1]，得白色固体OA-2(0.380 g，质量分数为76 %).

1.1.3 2，3-二氧代-齐墩果烷型-12-烯-28-羧酸乙酯的制备(OA-3)

化合物OA-2(0.380 g，0.79 mmol) 溶解于叔丁醇(30 mL)，加入叔丁醇钾(25 mg，2.22 mmol) 和四氢呋喃(3 mL)，50 ℃水浴反应6 h.蒸发去除溶剂，先用盐酸进行酸洗，再用食盐水进行水洗，无水硫酸镁干燥，减压抽滤，蒸发溶剂.粗品分离纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=50/1]，得白色固体OA-3(0.440 g，质量分数为89 %).

1.1.4 2，3-二酮肟-齐墩果烷型-12-烯-28-羧酸乙酯的制备(Ⅰ1)

化合物OA-3(0.440 g，0.70 mmol) 溶解于无水吡啶(20 mL)，加入盐酸羟胺(0.9 g，13.00 mmol)，120 ℃油浴回流1 h.冷却到室温时，有白色固体析出，然后过滤、干燥.粗品分离纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]，得白色固体Ⅰ1(0.320 g，质量分数为86 %).

制备化合物Ⅰ2～Ⅰ5时替换为不同的卤代烷，按上述方法操作.

1.1.5 3-氧代-齐墩果烷型-12-烯-28-酰氯的制备(OA-4)

中间体OA-1(0.470 g，1.05 mmol) 溶解于二氯甲烷(25 mL)，加入草酰氯(0.85 mL，1 mmol)和DMF(20 mL)，常温反应4 h.蒸发去除溶剂，加入适量环己烷移除残余草酰氯，减压脱溶，得淡黄色固体OA-4(0.370 g，质量分数为74 %)，直接进入下一步反应.

利用CPTU实测资料来估算土层重度，Larsson和Mulabdic（1991）通过对在瑞士、挪威和英国的试验资料的分析，提出采用净锥尖阻力（qt-σvo）和孔压参数比Bq对土的密度或重度进行估计。

1.1.6 3-氧代-齐墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺的制备(OA-5)

化合物OA-4(0.370 g，0.76 mmol) 溶解于二氯甲烷中，加入苯酰胺[n(OA-4)∶n(苯酰胺)=1∶1.2]和三乙胺(TEA，0.6 mL)，常温下反应过夜，蒸发去除溶剂.粗品经硅胶柱色谱分离、纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=60/1]，得淡黄色固体OA-5(0.280 g，质量分数为69 %).

1.1.7 2，3-二氧代-齐墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺的制备(OA-6)

化合物OA-5(0.280 g，0.55 mmol) 溶解于叔丁醇(30 mL)，加入叔丁醇钾(25 mg，2.22 mmol) 和四氢呋喃(3 mL)，50 ℃水浴反应6 h.蒸发去除溶剂，加入适量乙酸乙酯溶液溶解，先用盐酸进行酸洗，再用食盐水进行冲洗，最后用无水硫酸镁干燥、过滤、蒸发去除溶剂.粗品经硅胶柱色谱分离、纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=60/1]，得淡黄色固体OA-6(0.240 g，质量分数为85 %).

1.1.8 2，3-二酮肟-齐墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺的制备(Ⅱ1)

化合物OA-6(0.240 g，0.40 mmol) 溶解于无水吡啶中(20 mL)，加入盐酸羟胺(0.6 g，8.63 mmol)，120 ℃油浴回流1 h.冷却到室温时，有白色固体析出，然后过滤、干燥.粗品经硅胶柱色谱分离、纯化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]，得淡黄色固体Ⅱ1(0.200 g，质量分数为84 %).

制备化合物 Ⅱ2～Ⅱ5时替换为不同的胺类，按上述方法操作.

1.2 初步体外活性测试

以吉非替尼和阿霉素为阳性对照物，采用MTT法对合成的目标化合物进行体外抗肿瘤活性测试.选用人胃癌SGC7901和人肺癌A549细胞为靶细胞.在96孔培养板内培养对数生长期的肿瘤细胞，每100 μL约4 000个细胞.将其置于37 ℃、体积分数为5 %的CO2全湿条件培养24 h.将含有不同浓度的合成的10个新型衍生物加入到给药组，设置3个平行孔.阴性对照组加有等体积的溶剂(无血清的RPMI-1640培养基)，并设只加RPMI-1640培养基的空白对照组，置37 ℃、体积分数为5 %的CO2温箱中培养72 h，丢弃培养液，每孔加入MTT溶液50 μL，37 ℃ 下孵育4 h，丢弃上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，轻度振荡溶解甲臜颗粒.在酶标仪波长490 nm条件下测定光密度值(OD)，计算所测化合物对肿瘤细胞的抑制率和IC50值.实验重复3次，结果取平均值.

2 结果与讨论

2.1 目标化合物的确证

目标化合物结构经1H-NMR、MS等确证，数据见表1和表2.

表1 目标化合物的质谱和元素分析数据

表2 目标化合物的氢谱数据

所有目标化合物结构经1H-NMR、MS等确证，为10个未见报道的新型齐墩果酸衍生物.

2.2 生物活性评价

采用MTT法对目标化合物进行初步的体外抗肿瘤活性测试.选用吉非替尼和多柔比星为阳性对照物，人胃癌细胞SGC7901和人肺癌细胞A549为靶细胞，实验结果见表3.

由表3中分析可知：在一定浓度下目标化合物对SGC7901、A549均具有一定抑制作用，且活性强于母体OA.C-28位羧基成酯时，活性整体呈上升趋势，表明随着酯链的延长活性更佳；C-28位羧基成酰胺时，活性普遍强于成酯类；其中化合物Ⅱ5表现出良好的抗肿瘤活性，IC50值分别为10.76和13.28，与吉非替尼活性相当，可进一步研究.

3 结 论

以OA为先导化合物，对A环及C-28位羧基进行结构改造，设计合成了两类新型OA衍生物.经体外药理活性测试，C-28位羧基成酯或成酰胺，均能显著提高抗肿瘤活性，表明OA的活性位点主要来自于A环，这与Honda等发现化合物1的观点一致，说明对A环的结构改造至关重要.同时化合物Ⅱ5表现出较强的抑制活性，可能与苯环上带有吸电子基团有关，说明在C-28位连接带有强吸电子基团的结构更能提高抗肿瘤的活性，这也是本文的下一步研究方向.综上所述，本研究结果对进一步OA结构修饰有一定的参考意义.