褐煤高温水萃物生物产气及化学组成变化

2020-08-19任恒星柳方景王美林陈林勇元雪芳关嘉栋岳利娇

煤田地质与勘探 2020年4期

任恒星，何环，柳方景，王美林，赵娜，郭鑫，陈林勇，赵晗，元雪芳，关嘉栋，岳利娇

(1.煤与煤层气共采国家重点实验室，山西晋城 048000；2.中国矿业大学化工学院，江苏徐州 221116；3.中国矿业大学煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室，江苏徐州 221116)

生物成因煤层气是煤中有机物在微生物作用下被降解产生有机酸、芳香烃等，然后进一步被转化为乙酸和二氧化碳等小分子化合物并最终经产甲烷菌合成甲烷的过程[1-5]。当前，利用微生物厌氧降解煤中有机物产甲烷是煤层气增产领域的研究热点[6-8]。煤是一种含有大量芳环化合物的混合物，有机组成较为复杂，其组分的复杂性给生物产气机理研究带来很大困难。到目前为止，煤中具体哪种有机组分能被微生物利用产气还不清楚。赵同谦等[9]运用紫外和荧光光谱研究煤生物产气过程中可溶性有机物的变化特征，认为芳香族物质参与了生物产气过程；邵培[10]研究了中低阶煤有机地球化学特征对生物气生成的影响，认为黄铁矿和黏土矿物对生物气产生速率影响显著；陶明信等[11]研究淮南煤田煤中可溶有机质的生物降解特征，认为煤中的可溶有机质是生物成因甲烷产生的优先底物。也有学者通过溶剂萃取的方法分析煤生物产气的底物组成。葛晓光等[12]通过甲醇萃取研究煤有机成分与煤层水中硫酸盐还原菌(Sulfate Reducing Bacteira,SRB)的代谢关系，认为SRB 可厌氧降解利用甲醇萃取煤中大分子有机物；A.Furmann 等[13]用水、甲醇和二氯甲烷对烟煤进行萃取，利用萃取物进行生物产气研究，发现高镜质组煤的萃取物产气量高于低镜质组煤，可能是由于镜质组中含N、O、S 等官能团的有机物较多，为生物降解提供了化学位点。煤中除了存在大量的非水溶性有机物，还含有少量易溶于水的极性有机物，在生物与煤相互作用过程中，水溶性有机物能够快速均匀地分布于煤基质中，理论上优先被微生物利用。但是，煤中水溶性有机物极性大，不利于GC-MS 定性定量分析[14]。W.H.Orem 等[15-16]利用有机溶剂萃取结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，从煤层水和煤生物产气发酵液中检测到了酚和长链脂肪酸等多种有机物。A.Vieth 等[17]利用离子色谱法从不同煤的水萃物中检测到了低分子量有机酸，并认为这些物质是煤层微生物的潜在底物。尽管国内外研究人员对煤中生物产气的有机组分开展了相关工作，但整体上而言，其具体组成还有待进一步研究。近年来，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术已较为成熟，其综合了高效液相色谱的化合物分离和电喷雾离子源四级杆飞行时间质谱的灵敏检测，为分析极性至弱极性的热不稳定化合物提供了方法[18]。

笔者以实验室保存的产甲烷菌群为产气微生物，义马褐煤为产气底物，利用去离子水萃取结合减压蒸馏浓缩的方法提取褐煤中水溶性有机组分，并开展生物产气实验，综合利用 HPLC-MS 和GC-MS 方法研究生物产气前后煤中水溶性有机质的变化规律及其对产甲烷的贡献，以期为后续分析生物产气的物质基础提供参考。

1 材料与方法

1.1 褐煤样品与产甲烷菌群

褐煤样品采自河南义马千秋矿，去除表面氧化层后粉碎至120 目(125 μm)以下，70℃烘干后保存在充氮样品袋中备用，记为YM。褐煤工业分析和元素分析结果见表1。

表1 义马褐煤工业分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of Yima lignite

煤的萃取过程如下：取褐煤(YM)30 g 于烧杯中，加入450 mL 去离子水，70℃萃取48 h 后用普通定性滤纸过滤[19]，将滤液减压蒸馏浓缩30 倍，得到水溶物W1。将滤渣于70℃烘干至恒重，得到水萃余煤记为W2。褐煤的萃取率计算公式如下：

式中：p为萃取率，%；mYM为萃取前褐煤质量，g；mW2为萃余物质量，g。

采用实验室前期保存的产甲烷菌群作为菌源[20]，接种时每毫升菌源的总菌数为1.7×107个。产甲烷菌群培养所用培养基为：2.9 g K2HPO4，1.5 g KH2PO4，1.8 g NH4Cl，0.4 g MgCl2，0.2 g 酵母萃取物，0.5 g L-半胱氨酸盐酸盐，去离子水1 000 mL。

1.2 褐煤生物产气实验

生物产气实验分4 组，每组设3 组平行样，组别设置见表2。取250 mL 厌氧瓶作为反应容器，加入培养基120 mL，分别以水溶物(W1)、萃余煤(W2)和原煤(YM)作为底物，并以去离子水做空白对照。底物添加完成后封口灭菌，然后冷却至室温，每瓶接种5 mL 菌液，接种完成后放入30℃培养箱恒温培养进行生物产气实验，实验启动当天记作0 d，产气实验周期为45 d。各组的每克煤产甲烷量计算公式为：

式中：QE为实验组产气量，mL；φE为实验组甲烷体积分数，%；Q0为对照组产气量，mL；φ0为对照组甲烷体积分数，%；m为实验组换算原煤添加量，g；q为每克煤产甲烷量，mmol/g；22.4 为气体摩尔体积常数，mL/mmol。

采用GC-MS(Agilent，7890)分析生物产气过程中的气体成分，色谱柱为Carbonplot(60 m×320 μm×1.5 μm)，TCD 检测器，气密针进样，进样量0.5 mL。进样口温度150℃，柱温箱温度30℃，检测器温度200℃。

表2 生物产气实验设置Table 2 Experimental setup for biogas production

1.3 水溶性有机物的HPLC-MS 分析

水溶性有机物的HPLC-MS 分析步骤如下：①分别取W0、W1、W2、YM 实验组第0 天和第45 天的发酵液各10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤收集；②用HPLC-QTOF(液相色谱仪Agilent 1290，配备电喷雾离子源6530 QTOF)进行液体有机组分分析，色谱柱为安捷伦Zorbax C8(1.8 μm×4.6 mm×50 mm)，流动相为甲醇和0.1%甲酸，流速0.5 mL/min，柱温25℃，进样量10 μL。质谱采集模式为正离子模式，Fragmentor 电压130 V，毛细管电压3 500 V，质荷比扫描范围50～450。③采用Agilent MassHunter工作站分别对各样品总离子流色谱图进行化合物分子特征提取，用Agilent Mass Profiler Professional软件对生成的化合物进行空白扣除、筛选，选择在3 组平行样中同时出现的化合物用于分析。

1.4 甲醇萃取物的GC-MS 分析

为了考察生物作用后煤中极性有机物的生成情况，基于甲醇沸点低、易挥发特性，根据相似相溶原理，选取甲醇对褐煤进行萃取，便于萃取物样品的GC-MS 分析。GC-MS 分析步骤如下：①使用定性滤纸过滤收集W2 组产气实验后煤样，用150 mL去离子水清洗煤样3 次后，在70℃烘干至恒质量。②分别取1 g 实验前后的W2 组煤样，加入15 mL甲醇，65℃浸泡萃取72 h。使用旋转蒸发仪将甲醇萃取液浓缩至2 mL。③采用GC-MS(Agilent7890A/5795C)进行组分分析，色谱柱为VF-WAXms(30 m×250 μm×0.25 μm)，后运行温度为280℃，保持5 min，不分流进样，进样口温度为250℃，进样量0.8 μL，吹扫速率15 mL/min，吹扫时间0.2 min，载气为高纯度的氦气，柱流速1.0 mL/min，初始温度60℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率升温至250℃，保持20 min。

2 结果与讨论

2.1 产气量分析

义马褐煤的水溶物(W1)、水萃余煤(W2)和原煤(YM)的生物产气结果为：W2 和YM 的产甲烷量基本相等，分别为0.45 mmol/g 和0.46 mmol/g，而W1 的CH4产量为0.15 mmol/g。若将YM 和W2 产甲烷量的差作为YM 中水溶性有机物的产甲烷量，则YM 中水溶性有机物产甲烷量为0.01 mmol/g，远低于水溶物(W1)的产甲烷量 0.15 mmol/g。A.Furmann 等[13]研究发现烟煤在室温条件下用水萃取24 h 得到的萃取物经生物作用不能产生甲烷，且水萃物中未检测到有机物，认为在该萃取条件下水并不是从煤中萃取有机物的有效溶剂。而本研究中萃取温度为70℃，从W1 产气效果来看，该温度下使用水作为萃取剂可以将煤中水溶性物质萃取出来并被产甲烷菌群利用产生甲烷。另外，本研究中生物产气实验所用的培养温度为30℃，与A.Furmann等[13]使用的萃取温度相近，从W2 和YM 组产气结果可以判断，在30℃条件下YM 中水溶性有机物同样很难释放到发酵液中，因此，YM 和W2 产甲烷量基本相等，这也充分说明30℃条件下YM 中水溶性有机物对产气几乎没有贡献，而70℃萃取物中也基本包含了YM 的大量水溶性化合物。

2.2 义马褐煤水溶性有机物的化学组成

义马褐煤的W1、W2 和YM 生物产气前后发酵液质谱如图1 所示。生物产气前，W1 组发酵液中检测到190 种化合物，化合物种类和丰度远超W2组及YM 组，其种类上基本包含了W2 和YM 组的化合物，表明实验所用萃取方法能有效提取义马原煤中的水溶性有机物。W2 组和YM 组在化合物种类上基本相同，总共检测到41 种化合物，其种类仅占W1 中检测到的化合物的21%左右。生物产气后，在W1 组实验前发酵液检测到的190 种化合物中，有139 种化合物在发酵液中消失，这些化合物应该是微生物降解利用的底物。同时，在W1 组发酵液中新检测到23 种化合物，这些化合物应为水溶性有机物降解后形成的产物。YM 组和W2 组实验前发酵液中检测到的41 种化合物在实验后的丰度变化与W1 组基本相同。YM 组和W2 组实验后的发酵液中共新检测到7 种化合物，其中3 种化合物为W2 组、YM 组、W1 组所共有，剩余4 种为W1 组实验后的发酵液中未检测到的化合物，这4 种化合物应为煤中非水溶性有机物降解后的产物。结合气体产量数据综合分析，W1 组中含有丰富的水溶性有机物，且产气实验表明这些物质能被生物利用并产生甲烷。在W2 组煤中水溶性有机物被大部分去除的情况下，其产甲烷代谢过程主要利用非水溶性有机物，而根据W2 组和YM 组代谢产物和气体产量相似性，虽然YM 组煤中含有丰富水溶性有机物，但非水溶有机物仍然是甲烷的主要来源。

W1 产气前后发酵液的底物和产物分子量分布如图2 所示。从图中可以看出，底物分子量主要分布于200～300 Da，且分子量大于300 Da 的化合物较多；而产物的分子量主要分布在150～200 Da，且不含分子量大于300 Da 的化合物，说明经生物产气后分子量减小。在数量上，底物化合物的数量显著大于产物化合物数量，说明经生物作用后化合物数量明显减少。对W1 组、W2 组和YM 组的产物做分子式推测，误差小于3 mDa 的计算结果见表3。可以看出，这些化合物大多为含氧和氮化合物。结合元素分析数据，原煤中含氮量为1.39%，含氧量为16.44%。较高的杂原子含量为微生物降解提供了潜在位点[21]，生成了含氮和氧的产物。除化合物7—11外，其他化合物含8～13 个碳原子，且不饱和度大于6，而苯的不饱和度为4，表明分子结构中存在1 个以上的苯环结构，但具体的分子结构还需进一步鉴定。

图1 实验前后发酵液质谱图Fig.1 Mass spectra of fermentation broth before and after experiment

图2 W1 组底物与产物的分子量分布Fig.2 Molecular weight distribution of substrates and products of W1 group

表3 萃取物组、萃余物组和原煤组产物分子式计算结果Table 3 The molecular formula calculation results for products of extract group,residue group and raw coal group

2.3 义马褐煤甲醇萃取物的化学组成

义马褐煤水萃余煤(W2)经甲醇萃取后的 GCMS 结果如图3 所示。W2 组实验前后煤样的甲醇萃取物中均检测到了种类丰富酯类、烃类等非水溶性化合物，但是这些化合物实验前后的丰度无显著变化，说明这类物质很难被微生物降解利用。值得注意的是，在实验后甲醇萃取物中出现了实验前煤样甲醇萃取物中未检测到的甲酰胺、乙酰胺、亚硫酸二甲酯三种化合物，并且在W2 组实验后的发酵液中3 种物质的分子离子峰也不存在。这3 种化合物较其他酯类、烃类化合物水溶性高，且都含有杂原子。李文军等[22]研究了甲醇萃取对大雁褐煤孔隙结构的影响，认为甲醇能萃取游离或镶嵌于煤的大分子结构中的化合物。因此，推测这些物质可能是由微生物分解煤中非水溶性化合物后所产生，虽然这些化合物是水溶性的，但由于其游离或镶嵌于煤大分子结构中，其并未释放到培养液中，需要在甲醇萃取作用下才能释放出来。