李众，梁伟华，张贞，王宁，美尔·吐合塔米什，邹泓，顾文艺，齐妍*

(1石河子大学医学院病理系，新疆 石河子 832002； 2澳大利亚昆士兰大学生物工程与纳米研究所，澳大利亚 布里斯班 4702)

滑膜肉瘤(synovial sarcoma，SS)是软组织肉瘤中最具上皮分化特征的恶性肿瘤之一，约占所有软组织肉瘤的10%，SS可发生在任何年龄和任何部位，但主要好发于15到35岁的青少年，发生部位主要为四肢，少数发生在头颈部和躯干[1]。在SS组织学分型中以单相纤维型(MFSS)和双相型(BSS)最为常见。目前SS患者治疗后整体预后较差，因此寻求新的靶向药物提高患者预后生存率是亟待解决的问题。

POLO样激酶1(Polo-like kinase1，PLK1)是一种广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并且参与有丝分裂中的中心体复制、纺锤体形成和染色体分离等多个过程[2]。目前已证实PLK1在人类大多数肿瘤中如胃癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等过表达，通过利用siRNA或特异性激酶抑制剂阻断PLK1表达，能有效抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，延缓肿瘤发展进程，继而改善患者预后[3-5]，但PLK1在软组织肿瘤中研究甚少。本研究通过检测PLK1蛋白在SS组织中的表达，分析其与SS患者临床病理参数及预后的相关性，为SS临床诊治及分子机制研究提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本情况，患者随访情况及相关试剂

收集1968年至2019年间石河子大学第一附属医院病理科和新疆医科大学第一附属医院病理科46例SS患者的手术存档蜡块，选择23例非肿瘤样本作为对照组(7例肿瘤旁肌组织和16例慢性滑膜炎)，所有患者的组织病理检查结果均已明确诊断，组织学分级根据FNCLCC(法国国家癌症控制中心联合会)分级，临床分期根据2016版软组织肿瘤NCCN指南。46例SS患者中随访例数为28例，因联系方式或住址更换等原因导致失访18例，随访率为60.87%。主要试剂为兔抗人PLK1 单克隆抗体，购自英国Abcam 公司，稀释浓度为 1∶500，采用Envision二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，设立空白、阳性及阴性对照。

1.2 免疫组化评分标准

免疫组化评分由2名经验丰富的病理医师采取双盲法独立阅片，当结果出现差异时，由上级医师判定最终结果。显微镜下随机选取10个400倍视野，观察每个视野下SS组织染色强度并记录阳性细胞所占比例。PLK1阳性细胞以细胞核呈棕褐色颗粒计为染色阳性。阳性细胞所占百分比小于5%，计0分；6%～25%，计1分；26%～50%，计2分；51%～75%，计3分；76%～100%，计4分。阳性细胞染色强度为无着色，计0分；浅棕着色，计1分；棕黄色着色，计2分；棕褐色着色，计3分。两项相乘后得分0～1分为-，2～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++。本研究++以上计为强阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，PLK1与SS患者临床病理参数之间及PLK1在SS组织中与对照组织中的差异性检验选用连续性校正卡方检验，通过Kaplan-Meier法分析 PLK1表达与SS患者预后的关系，运用Cox回归模型对SS患者生存时间进行单因素及多因素分析，P<0.05认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 PLK1在不同类型SS组织中的表达情况

PLK1在SS组织中呈现明显的胞核着色，PLK1在SS组织均为高表达，阳性率为78.26%(36/46)，强阳性率为45.65%(21/46)，在BSS中(图1A)，阳性率76.92%(30/39)，强阳性率43.59%(17/39)，在MFSS中(图1B)，阳性率85.71%(6/7)，强阳性率57.14%(4/7)。在对照组中(图1C,D)，PLK1呈低表达，阳性率26.09%(6/23)，两组之间差异具有统计学意义(χ2=17.524，P<0.001)(表1)。

图1 PLK1在SS不同组织类型及对照组中的免疫组化染色结果图

2.2 PLK1蛋白表达与SS患者临床病理参数的关系

2.2.1 年龄、性别及发病部位

本组46例SS诊断时最小年龄10岁，最大年龄70岁，平均年龄 37岁，男性25 例，女性 21例，男女比例接近1∶1，发病高峰年龄段15～35岁(占42.83%)，本研究年龄分界线为20岁时统计学差异最显著，PLK1在大于20岁患者中的表达明显高于小于20岁的患者(χ2=4.064，P=0.044)；46例SS中发生于四肢29例，躯干12例，头颈部3例，盆腔/腹膜2例，四肢和躯干所占比例较高，为63.04%和26.09%，PLK1的表达与性别(P=0.963)和发病部位(P=0.647)无统计学差异(表2)。

2.2.2 组织学分型、肿瘤大小及是否转移

在本研究收集的46例SS患者中，MFSS占15.22%(7/46)，BSS占84.78%(39/46)，原发肿瘤直径大于5 cm患者占67.39%(31/46)，小于5 cm占32.61%(15/46)，发生转移患者占32.61%(15/46)，未发生转移占67.39%(31/46)。结果显示PLK1表达与组织学分型(P=0.983)、肿瘤大小(P=0.855)及是否转移(P=0.562)无显著相关性(表2)。

2.2.3 组织学分级及临床分期

本组46例SS中FNCLCC分级I-II级患者12例，III级34例；TNM分级中I-II级患者17例，III-IV级29例；结果显示，PLK1在患者FNCLCC分级III级中的表达明显高于I-II级(χ2=5.540，P=0.019)，临床分期III-IV期中的表达明显高于I-II期(χ2=4.313，P=0.038)，提示PLK1高表达有可能促进SS发生发展(表2)。

表2 PLK1表达与SS患者临床病理参数的关系

2.3 PLK1表达水平与SS患者生存时间的相关性

通过Cox回归模型，分别探讨性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、组织学分型、FNCLCC分级、TNM分期和肿瘤转移等临床病理参数以及PLK1表达水平对患者生存时间的影响。

单因素 Cox 回归分析显示，TNM分期III-IV期(P=0.019)、PLK1高表达(P=0.042)和肿瘤发生转移(P=0.002)是影响SS患者生存时间的危险因素，多因素Cox回归分析结果显示，肿瘤发生转移是患者生存时间的独立危险因素(P=0.002)(表3)。

表3 SS患者生存时间单因素及多因素Cox回归分析

28例SS患者随访时间为3～69个月，中位随访时间为37个月，其中8例存活，20例死亡。PLK1表达阳性患者生存时间(3～69个月，中位时间为23个月)明显少于PLK1表达阴性患者(25～65个月，中位时间为52个月)，两组差异有统计学意义(χ2=4.571，P=0.033)(图2)，提示PLK1高表达患者预后差。

图2 PLK1表达状态和SS患者临床预后的相关性

3 讨论

SS好发于青少年，侵袭能力较强且对放化疗药物不敏感，临床目前对于SS治疗采用以手术广泛切除为主，放疗化疗辅助治疗模式，但根据美国国家癌症研究所的流行病学数据库资料显示，近30年来 SS患者生存期及临床治疗未得到明显改善，患者5年生存率仅约60%[6]，且不同年龄段预后不同。Wang等[7]对999名SS患者10年的生存情况进行统计分析，结果显示在小于15岁SS患者中10年存活率为80%，而在大于15岁SS患者10年整体存活率仅约为40%，且随着患者年龄增加，预后越差，同时显示转移性SS与局灶性SS相比，患者预后更差。本研究因病例数较少，SS患者预后与年龄之间无明显相关性，但PLK1表达在大于20岁的患者中明显高于小于20岁患者，且PLK1高表达提示患者预后差。SS在2016版WHO仍被归为组织起源不定的软组织肉瘤，近年来认为SS是干细胞源性恶性肿瘤[8]，因此，在临床研究中，样本对照的选择始终存在一定困扰。近期Pazzaglia等[9]检测miR-494.3p在42例滑膜肉瘤组织的表达情况，采用非肿瘤组织作为对照，结果显示miR-494.3p表达在SS组织中明显低于对照组，提示miR-494.3p具有抑癌作用。本研究结果显示，PLK1在SS组织中的表达明显高于非肿瘤组，提示PLK1具有促癌作用，这些为SS相关研究带来一定参考价值。

PLK1因其在肿瘤细胞周期中发挥重要的调控作用而受到广泛关注，研究显示 PLK1 在肿瘤细胞分裂周期中主要在G2/M 期发挥作用[10]，通过参与调控肿瘤细胞G2/M 期转化及 DNA的复制,激活调节细胞生长和代谢相关途径的腺苷酸活化酶等下游信号分子，从而发挥促进中心体的成熟、染色体的分离及胞质分裂的作用[11-12]。PLK1抑制剂或siRNA可显著抑制PLK1表达，引起肿瘤细胞发生明显的G2/M期阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导其发生凋亡，从而延缓肿瘤发生发展进程，改善患者预后[13-15]。这引起一些学者的高度关注，近年来，陆续出现不同的PLK1抑制剂，且有些研究小组已经将PLK1抑制剂作为抗肿瘤药物进行研究。Stadler等[16]将PLK1抑制剂Volasertib用于50例尿路上皮癌患者的临床二期研究，注射剂量为300 mg，每三周注射一次，结果显示在患者体内注射药物后并未引起明显的不良反应，同时观测到Volasertib对肿瘤活性产生了一定抑制作用。Olmos[17]和Frost[18]研究小组分别将PLK1抑制剂GSK461364 和BI2536用于临床一期研究，取得了相似的结果。由此，我们推测PLK1抑制剂有望成为SS的靶向治疗药物，为患者临床治疗带来曙光。

目前对于PLK1在SS中的研究相对较少，PLK1在SS发生发展中如何发挥作用尚不清楚。SS分子遗传学改变最具特征的是特异性染色体易位t(X；18)(p11.2；q11.2)及其融合基因SS18-SSX的发现，90%以上的患者中存在SS18-SSX高表达，且在SS发生发展中起到关键致瘤作用[19-21]，这使人们认识到特异性染色体易位可能是滑膜肉瘤发生的早期事件，SS18-SSX的表达产物作为异常转录辅助因子可能参与滑膜肉瘤的分化和发生发展，但通过哪些关键因子导致肿瘤发生，具体机制不详。Isfort等[22]发现在SS细胞系中SS18-SSX融合基因高表达可以激活PLK1下游 YAP/TAZ信号通路，从而促进SS细胞增殖，反之沉默SS18-SSX融合基因表达则会使抑制YAP/TAZ通路，导致SS细胞增殖受到抑制。有趣的是，此研究还显示PLK1表达水平会随着SS18-SSX融合基因表达升高而升高，提示PLK1有可能对SS18-SSX融合基因有一定的调控作用。Slotkin等[23]发现在SYO-1细胞系中沉默SS18-SSX融合基因下游的G1/S期调控蛋白SHCBP1可以明显激活PLK1分子下游PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而降低Cyclin D1的表达，使SS细胞增殖受到抑制。Setsu等[24]在112例SS患者样本中发现PLK1下游Akt/mTOR通路处于激活状态，后者可以激活4E结合蛋白1(4E-BP1)，高表达的4E-BP1与SS出现异常有丝分裂、坏死以及侵袭密切相关。本研究结果同样显示，PLK1表达与异常有丝分裂、坏死、临床分期密切相关，其表达越高，组织学分级及临床分期越高。综上所述，我们可以看出PLK1可通过激活不同下游信号通路，在SS发生发展中可能发挥重要的作用，具体机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究初步发现PLK1表达与SS患者临床病理参数及预后存在密切关系，其高表达提示预后差，表明PLK1可能参与了SS的发生发展，并可能成为SS分子治疗的潜在靶点，为后续的深入探讨奠定了研究基础。