赵海燕,许 钰,班颖芳,蔡吉祥*

(1.广西科技师范学院 食品与生化工程学院，广西 来宾 546119;2.广西科技师范学院 瑶医瑶药重点实验室，广西 来宾 546119)

莪术为姜科植物蓬莪术、广西莪术或温郁金的干燥根茎。其具有行气破血、消积止痛等功效[1]。广西莪术也称桂莪术，系广西莪术 (Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang )的干燥根茎，为广西的道地药材[2]。现代研究表明莪术挥发油具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗菌、护肝等多种药理活性作用[3]。目前莪术挥发油常用的提取方法有水蒸气蒸馏法[4-5]、超临界流体萃取法[6]、索氏提取法[7]等。微波辅助提取技术因有提取时间短、能耗低、溶剂用量少、提取率高、成本低等特点近年来在植物挥发油提取方面应用广泛[8-9]。本实验以广西莪术为原料，利用微波辅助提取法，通过单因素和正交实验优化微波辅助提取挥发油工艺，并分析其抗氧化活性，为优化广西莪术莪术油提取工艺提供参考，以期为广西莪术油进一步开发利用提供基础理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

广西莪术购买于亳州市众益堂中药材销售有限公司。其经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室张鹏博士鉴定为广西莪术。DPPH·(上海思诚化工科技有限公司)，三氯化铁、三氯乙酸、铁氰化钾、七水合硫酸亚铁、水杨酸(武汉长城化成科技发展有限公司)，乙醇、双氧水、抗坏血酸(四川西陇科学有限公司)，等试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

FW-135 型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；RS-232型精密电子太平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；GZX-GF101-3 BS型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(III)型循环水多用真空泵(巩义市科瑞仪器有限公司)；XH-MC-1型实验室微波催化合成/反应仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；HH-S4 型恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；UV-9600 型 紫外/可见分光光度计(北京北分瑞利分析仪器公司)。

2 实验方法

2.1 微波辅助提取工艺优化方法

2.1.1 微波提取挥发油方法

准确称取干燥广西莪术粉末(粉碎后60目过筛)20.0 g，将一定量的无水乙醇倒入三口烧瓶内摇匀，置于实验室微波催化合成仪内，以一定的功率提取一定时间后，抽滤数次至滤纸无残渣。滤液在旋转蒸发仪上挥干溶液，于恒温干燥箱中干燥称重。按照下式计算莪术油提取率：

式中m1为莪术粉原料质量；m2为空圆底烧瓶质量；m3为有挥发油的圆底烧瓶质量。

2.1.2 单因素试验

通过单因素实验初步分析莪术粉与无水乙醇液料比、提取时间和微波功率三个单因素对莪术油提取率的影响。称取处理后的莪术粉20.0 g，单因素梯度分别为：无水乙醇与莪术粉料液比(A)1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 g / mL；提取时间(B)3，4，5，6，7 min；微波功率(C)500，600，700，800，900 W，每进行一组试验，选定一定因素梯度，再逐一进行其他单因素考察。

2.1.3 正交试验

三个单因素试验后每个因素选三个水平进行正交试验，得到正交优化后的微波萃取法提取莪术油的最佳工艺条件。并确定最佳工艺条件下挥发油提取率。

2.2 体外抗氧化活性测定方法

2.2.1 还原能力测定

微波辅助提取的莪术挥发油还原能力测定采用铁氰化钾氧化法[10]。阳性对照品为抗坏血酸(Vc)。取3.0 mL不同浓度的样品溶液(或对照品溶液)依次加入3.0 mL的磷酸缓冲液(pH值= 6.6)和3.0 mL铁氰化钾溶液(1 %)，混匀后50 ℃水浴保温20 min。再加入3.0 mL的三氯乙酸溶液(10%)。混匀后取上述混合液4.0 mL，加入4.0 mL去离子水和0.8 mL的三氯化铁(0.1%)溶液，静置10 min。用去离子水为空白调零，在700 nm下其测吸光值。每个浓度组平行做3次，取其平均值。吸光值越大表示还原能力越强。

2.2.2 清除DPPH·自由基能力测定

取5 mL 6 ×10-55 mol /L的DPPH·乙醇溶液，加入1 mL 不同浓度的样品溶液，利用漩涡混合器混匀后，室温静置30min，在517nm测吸光值，并且测得样品对DPPH·的清除百分率[11]。DPPH·清除百分率SE(%)计算式为：

(1)

式中：A0是去离子水作为空白对照的吸光度值，AX为含样品溶液的吸光度值。Ay 为不加显色剂药液的本底光密度。

2.2.3 清除羟基自由基能力测定

采用Fenton法[12-13]测定微波辅助提取的挥发油对·OH的清除能力。具体步骤为分别取9 mmol/L Fe2SO4溶液、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、不同浓度(200,100,50,25,12.5 μg / mL)的待测样品溶液(或Vc 溶液)各2.5 mL，加0.25mL 的0.03 % H2O2。同时设空白对照组，稀释样品的溶剂空白对照。混匀后静置30min，在510nm测其吸光值。样品组和阳性对照组对·OH的清除率SE(%)按(1)式计算。其中A0为以溶剂代替药液的试剂空白管的吸光度。

3 实验结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 料液比对挥发油提取率的影响

选定提取时间5 min、微波功率700 W，分析液料比对莪术油提取率的影响见图1。从图可以看出液料不同比挥发油提取率不同，料液比小于1∶15 g/mL时，料液比增大莪术油的提取率增加；液料比1∶15 g/mL时提取率达到最高；液料比再增大，提取率开始下降。最佳料液比为1∶15 g/mL时，莪术油提取率为4.65 %。

图1 料液比对挥发油提取率(%)的影响

3.1.2 提取时间对挥发油提取率的影响

根据料液比试验结果选定液料比1∶15 g / mL、微波功率700 W，研究提取时间对莪术油提取率的影响。从图2可以看出提取时间对莪术油的提取率有显著影响。微波提取时间为5 min时，莪术油提取率最大，提取率为4.71%

图2 提取时间对挥发油提取率(%)的影响

3.1.3 微波功率对挥发油提取率的影响

通过以上单因素实验选定料液比为1∶15 g / mL、提取时间为5 min，研究微波功率对挥发油提取率的影响。试验结果(图3)显示总体上随着微波功率不断增大提取率不断增加，但当微波功率超过800 W后，莪术油提取率略微下降的趋势，分析原因可能是微波功率过大，导致蒸汽生成速率偏大，不能很好地收集挥发油导致的。因此本实验选择最佳微波功率条件为800 W，此时提取率为5.11 %。

图3 微波功率对挥发油提取率(%)的影响

3.2 正交试验结果

根据单因素试验结果设计正交试验表，如表1。

表1 正交试验因素与水平表

按照正交试验表试验后得到正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果表

以上正交试验结果表明，对挥发油提取率影响最大的因素为功率，其次是提取时间，料液比对挥发油提取率的影响相对较小。且从正交表中可观察到优化后最佳工艺条件组合为A3B3C1。由于极差分析得到的较优水平A3B3C1与正交表中最佳水平条件组合A2B3C1不一致。所以按照A3B3C1条件组合重新测定挥发油含量，重复三次取平均值，得挥发油提取率为5.18 %。最后确定最佳工艺条件为料液比1∶20 g / mL，提取时间6 min，微波功率900 W。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 还原能力测定结果

化合物还原能力的强弱，可以反映药物的潜在抗氧化性能，是体外抗氧化的一个重要指标[5-7]。

图4 挥发油和Vc的还原能力测定曲线图

从图4可知挥发油的还原能力在一定浓度范围(12.5～200 μg / mL)内随着样品浓度增加还原性增强，并且当浓度大于100 μg / mL时，挥发油的还原性明显好于阳性对照品Vc。

3.3.2 清除自由基能力测定结果

挥发油清除DPPH·和·OH能力测定结果见图5、图6。从图中曲线趋势可以看出相比于阳性对照Vc，挥发油对DPPH·和·OH的清除都有较好的效果。当样品浓度达到200 μg / mL时，挥发油对·OH的清除率可以达到70.5 %，对DPPH·的清除率可达到59.5 %。以上结果表明微波辅助提取的广西莪术挥发油显示了较好的清除自由基活性。

图5 挥发油对DPPH·清除率(%)的影响

图6 挥发油对羟基自由基清除率(%)的影响

4 小结

本文通过单因素和正交试验优化了微波辅助提取广西莪术挥发油的提取工艺，得到最佳工艺条件为料液比1∶20 g / mL，微波提取时间5 min，微谱功率900 W，最佳工艺条件下挥发油的提取率为5.18 %。以Vc为阳性对照，分析得到的挥发油的还原性能力和清除·OH和DPPH·能力，结果表明微波辅助提取得到的挥发油在浓度大于100 μg / mL时还原性好于Vc，在12.5～200 μg / mL的浓度范围内随样品浓度增加对·OH和DPPH·的清除率逐渐增大，在200 μg / mL时对以上两种自由基清除率分别可达到70.5 %和59.5 %，显示了很好的抗氧化效果。