钟炜祥，韦晰凤，温 群

(1.赣南医学院第一附属医院心胸外科； 2.赣州市妇幼保健院门诊部，江西 赣州 341000)

表皮生长因子受体(EGFR)基因是肺癌分子靶向治疗的主要靶点，与目前广泛应用于临床的吉非替尼、厄洛替尼及埃克替尼等小分子EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)敏感性显著相关，在肺腺癌的治疗中显示出很好的抗肿瘤疗效[1-2]。在中国，EGFR基因突变存在显著的地域差异，目前赣南地区尚无相关报道。本研究通过DNA测序结合扩增耐突变系统(ARMS)法检测赣南地区原发性肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况并分析其与肺腺癌患者性别、吸烟情况及TNM分期等临床病理特征的关系，旨在探讨赣南地区原发性肺腺癌EGFR基因突变的特点，为筛选最合适的肺癌患者进行EGFR-TKIs治疗提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取赣南医学院第一附属医院心胸外科、肿瘤科及呼吸内科于2016年1月至2017年12月经外科手术切除(30例)或CT引导下经皮肺穿刺活检(78例)或电子支气管镜活检(18例)组织标本126例，均通过组织病理学检查确诊为原发性肺腺癌。其中男69例(54.76%),女57例(45.24%)；年龄33～78岁，中位年龄60岁；无吸烟史72例(57.14%)，有吸烟史54例(42.86%)；按国际抗癌联盟标准(第八版)进行临床分期，Ⅰ期12例(9.52%)、Ⅱ期8例(6.35%)，Ⅲ期32例(25.40%)，Ⅳ期74例(58.73%)。入组患者遍布赣南地区十八县市区，均为初治，未行靶向及放化疗。

1.2 研究方法

1.2.1 标本固定和DNA提取

由医院病理科常规进行石蜡包埋固定，按至少5 μm厚度切取病理白片5～10张外送。126例组织标本按时间先后分成2组，一组(2016年)含81例样本外送至上海宝藤医学检验所，另一组(2017年)含45例样本外送至浙江鼎晶医学检验有限公司。采用QIAamp DNA FFPE提取试剂盒(QIAGEN)提取样本DNA，应用分光光度计检测DNA纯度和浓度。

1.2.2 EGFR基因突变检测

上海宝藤医学检验所采用DNA测序法，先将抽提好的DNA进行PCR扩增，再将扩增产物、相应的试剂和设计的引物一起加入3730/3130基因测序仪进行上机测序，最后将得到的基因序列与Genbank中的EGFR基因标准序列(序列号：NG_007726)进行比对，分析测序结果；浙江鼎晶医学检验有限公司采用ARMS-PNA(肽核酸)技术检测EGFR基因第18、19、20、21外显子突变，具体操作方法参照人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(武汉海吉力生物科技有限公司，注册证书编号：3400973)说明进行。

1.3 统计学方法

应用SPSS24.0软件，计数资料以百分数表示，比较采用χ2检验或确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因外显子18、19、20及21突变分析

在126例标本中，检测出64例EGFR基因突变，突变率为50.79%。其中，19外显子突变(Exon19)45例，占突变病例70.3%(45/64)，均为delE746-A750(即19del)；21外显子(Exon21)突变14例，占突变病例21.9%(14/64)，均为L858R(2573T→G)；18外显子(Exon18)突变2例，占突变病例3.1%(2/64)，均为G719A(C→G)；Exon21、外显子20(Exon20)二联突变2例，突变类型为L858R+T790M；Exon19、Exon20二联突变1例，突变类型为19delE746-A750+T790M。见表1和图1—2。

表1 EGFR突变分析 n=64

2.2 EGFR基因突变与肺癌各临床病理特征的关系

女性患者突变率66.7%(38/57)明显高于男性37.7%(26/69)，不吸烟患者突变率59.7%(43/72)明显高于吸烟患者38.9%(21/54)，两者之间差异均有统计学意义(P<0.05)；EGFR突变在年龄分布和TNM分期方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 赣南地区肺腺癌患者EGFR基因突变与临床病理特征的关系 n=106

2.3 EGFR基因19del、L858R突变与肺癌各临床病理特征的关系

EGFR基因19del、L858R突变患者在性别、年龄、吸烟状况以及TNM分期方面进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 EGFR外显子19、21突变与临床病理特征的关系

3 讨论

目前肺癌的治疗已迈入“精准医疗”时代，EGFR基因是目前研究最透彻的分子靶点。EGFR基因位于7号染色体短臂7p12—14区，由28个外显子组成，其酪氨酸激酶功能区由外显子18—24编码,使用TKIs的有效性与EGFR外显子18—21突变有关[3-4]。基因突变位于EGFR酪氨酸激酶活性区域的ATP结合位点，TKIs通过与ATP竞争结合EGFR胞内酪氨酸激酶区，阻止酪氨酸残基磷酸化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终达到抑制肿瘤增殖、转移、血管生成等一系列肿瘤细胞生物活动[5]，进而有效治疗EGFR基因突变的肺癌患者。因此，EGFR突变可以作为非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR-TKIs治疗敏感性的预测因子，通过检测EGFR突变的情况可以指导靶向用药及针对性的个体化治疗。本研究结果显示，赣南地区原发性肺腺癌EGFR基因突变率为50.79%(64/126)，女性、不吸烟患者突变率明显高于男性、吸烟患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。这与国内[6]、外[4]文献报道相似，进一步证实了EGFR突变多见于女性且不吸烟肺腺癌患者。

目前为止所发现的EGFR突变均发生于EGFR基因的外显子18—21，其中19del和L858R为其最常见突变类型，约占NSCLC中所有EGFR突变类型的85%左右[7]。本研究纳入126例病例，其中19del突变45例，占突变病例70.3%(45/64)；21外显子突变(均为L858R)14例，占突变病例21.9%(14/64)；18外显子突变(均为G719A)2例，占突变病例3.1%(2/64)。经测序证实，19del突变均为核苷酸序列中第2235—2249位碱基缺失，导致EGFR蛋白第746—750位氨基酸丢失，简称delE746-A750；L858R突变则是外显子21第858位密码子发生碱基(T→G)替换突变，引起第2573位亮氨酸(L)转变为精氨酸(R)；G719A突变指第719位的甘氨酸被丙氨酸(G719A)取代。此外，第20外显子T790M突变指外显子20中第790氨基酸位点的苏氨酸(T)被甲硫氨酸(M)替代，基因水平表现是ACG突变成ATG。未经EGFR-TKIs治疗的NSCLC病例检测到T790M基因突变称为原发T790M突变，常常与其他EGFR位点突变同时出现，据文献[8-9]报道，70%～80%合并L858R，其次为19del。本研究检测出3例第20外显子点突变，均为原发T790M突变，其中2例联合L858R突变，1例联合19del突变，此结果与文献[8-9]报道一致。多项研究[10]证实，原发T790M突变会降低一代EGFR-TKIs的疗效，奥希替尼作为第三代EGFR-TKIs可同时作用于EGFR活性突变和T790M耐药突变[11]。

据国内文献报道，四川[6]、云南宣威地区[12]EGFR基因突变以21外显子为主，湖南[13]、广东[14]地区EGFR基因突变以19外显子为主，上海[15]、安徽[16]、广西南宁[17]地区则以19外显子和21外显子为主，且两者之间没有区别。本研究表明赣南地区原发性肺腺癌中EGFR突变以19del突变为主，与湖南、广东地区报道的一致，进一步证实了中国大陆各地区之间EGFR基因突变类型存在显著差异，可能与遗传背景、民族、环境等因素有关。随着EGFR-TKIs在敏感突变的NSCLC患者中的广泛应用,目前关于不同类型的EGFR突变对EGFR-TKIs敏感性不同的研究[18-20]较多，比较公认的是19del突变较L858R突变患者对TKIs的治疗更敏感。本研究结果显示赣南地区原发性肺腺癌患者中19del突变多见，提示在EGFR-TKIs治疗中获益更大。亚组分析了EGFR基因19del和L858R突变在赣南地区原发性肺腺癌患者性别、年龄、吸烟状况及TNM分期方面，均无明显差异。

本研究不同时间段采取DNA测序和ARMS法进行EGFR基因突变检测。2016年入组的病例送至上海宝藤医学检验所采取直接测序法，具有直观、准确性和特异性高的优点，可检测已知和未知突变，是EGFR基因突变检测的常用方法。为保证标本中肿瘤组织含量，尤其是活检小标本如经皮肺穿刺或电子支气管镜活检组织标本，要求病理科切取病理白片时须保障白片厚度至少5 μm，且规定活检小标本送检10张白片，手术切除标本送检5张白片。同时在组织DNA提取后使用分光光度计检测DNA纯度和浓度，质控标准为DNA浓度不低于20 ng·μL-1，OD260/OD280在1.8～2.0之间。通过以上措施来提高突变检测率，克服测序法灵敏度不高的缺点。2017年入组的病例送至浙江鼎晶医学检验有限公司，采用ARMS-PNA技术，结合荧光PCR平台，检测人类EGFR基因上的30种不同的突变。与测序法相比，ARMS检测方法灵敏度更高，检测周期更短，操作相对简单，能检测到DNA中含量低至1%的突变基因。不足之处是当ARMS法检出外显子突变，需结合测序法才能明确具体的突变位点和突变类型。本研究中，45例病例采用DNA测序法检测出23例EGFR突变，68例病例采用ARMS法检测出33例EGFR突变，二者之间差异无统计学意义(χ2=0.72，P=0.788)。其余13例病例同时采取DNA测序和ARMS法进行检测。

综上所述，赣南地区原发性肺腺癌患者EGFR基因突变率较高，与患者的性别、吸烟状况相关，主要见于女性、不吸烟患者，突变类型以19del突变为主，提示更能从EGFR-TKIs治疗中获益。明确赣南地区原发性肺腺癌患者EGFR基因突变的特点，指导赣南地区肺癌患者个体化治疗，为赣南地区筛选最合适的肺癌患者进行EGFR-TKIs治疗提供临床依据，进而建立赣南地区肺癌靶向治疗模式并推广应用于临床。

致谢：

感谢上海宝藤医学检验所和浙江鼎晶医学检验有限公司在本研究EGFR基因突变检测方面提供的帮助。