郑 颖，李小华，李香营，陈漠水

(中南大学湘雅医学院附属海口医院，海口市人民医院心血管内科，海口 570208)

高血压继发左心室肥厚和心肌纤维化诱发心衰，故逆转左心室肥厚和心肌纤维化已成为高血压治疗的潜在策略之一[1]。小檗碱(BBR)又称黄连素，其可有效地抑制左心室肥厚，以及抑制多种因素导致的心肌纤维化，改善心功能[2]。microRNAs(miRNAs)是一种短链非编码RNA，在转录后水平调节基因的表达，miRNAs参与高血压等慢性后负荷增加导致的以心肌肥厚和心肌纤维化为特点的心肌重构[3]。最近有研究[4]提示小檗碱可能对miR-29b有调控作用，干预心肌纤维化。本研究拟通过腹主动脉缩窄法建立压力超负荷大鼠心肌肥厚模型，探讨小檗碱对大鼠高血压左室肥厚形成过程中心肌纤维化的预防作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1)动物：雄性健康SD大鼠40只，体重200 g左右，上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK(沪)2017-0005。

2)主要仪器：微量核酸蛋白分光光度计Nanodrop ND-2000C(美国Thermo Fisher Scientific)、T100 PCR仪(美国Bio-Rad)、CFX connect定量PCR仪(美国Bio-Rad)。

3)主要药物与试剂：盐酸小檗碱(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：B139120)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；Masson三色染液(珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA4079B)；相关分子生物学耗材均购自Axygen公司，均为无RNase、DNase产品；逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit购自TaKaRa公司(货号：RR037A)，SuperReal PreMix Color(SYBR Green)购自TIANGEN公司(货号：FP215-02)，Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set(广州Ribobio公司，货号：miRQ0000801-1-2)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模、分组与给药

将40只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)10只与手术组30只。手术组采用腹主动脉缩窄法制备压力负荷性大鼠模型：以10%水合氯醛[0.35 mL·(100 g)-1)]腹腔注射麻醉，麻醉后腹部脱毛、消毒，经下腹部脐中线分层切开腹腔，在双肾动脉上段0.5 cm处分离腹主动脉，放置直径为0.6 mm的小圆棒(缩窄后腹主动脉外径约0.6 mm)，紧贴腹主动脉，平行放置，用4号手术丝线将腹主动脉和小圆棒一起结扎，而后抽出小圆棒使腹主动脉缩窄。假手术组只暴露分离腹主动脉后关腹腔不做任何处理，术后连续3 d用10万U青霉素钠肌内注射预防感染。

将手术组造模成活大鼠24只按随机数字表法分为模型组(Model组)12只和小檗碱组(BBR组)12只。BBR组将盐酸小檗碱用0.5%羧甲基纤维素钠配置成混悬液，术后1周予灌胃给药，100 mg·kg-1·d-1；Sham组及Model组予等量生理盐水灌胃。分别于术后8周进行取材，心尖部分取材置于4%多聚甲醛固定做病理检测，其余部分液氮闪冻后，-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 心脏肥大指数计算

处死大鼠前称取大鼠体重，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血处死大鼠，迅速开胸取出完整心脏，用冰浴预冷生理盐水洗净残血，滤纸吸干心脏并用天平(万分之一)称取心脏重量，计算心脏肥大指数(HW/BW)。HW/BW=心脏重量(g)/体重(kg)。

1.2.3 Masson染色法检测心肌间质胶原沉积

心肌组织包埋切片后，厚度4 μm，切片脱蜡至水，Weigert铁苏木素染色5～10 min，流水稍洗、1%盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟、丽春红酸性品红染液染5～10 min，流水稍洗、磷钼酸溶液处理约5 min，不用水洗直接加甲苯胺蓝染液或亮绿复染5 min、1%冰醋酸处理1 min，95%酒精脱水多次、无水酒精脱水，二甲苯透明，中心树胶封固。采用图像分析软件Image-pro plus 6.0测量胶原蛋白体积分数(collagenvolume fraction，CVF)，即胶原纤维区所占观察视野的百分比，每张切片随机选取5个视野进行测量，计算其均值，作为心肌纤维化指标。

1.2.4 RT-PCR法检测心肌组织miRNA-29b及其靶基因的表达

使用Generay公司高纯总RNA快速提取试剂盒提取心肌组织总RNA，按试剂盒说明书操作，使用Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set(广州Ribobio公司)检测大鼠miRNA-29b，Bulge-LoopTMmiRNA primer与miRNA 3′端结合，逆转录酶催化逆转录成cDNA，以U6 snRNA为内参照使用FX connect实时荧光定量PCR仪定量miRNA-29b的表达，反应条件：95 ℃ 预变性20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，进行40个循环，实验结果由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动进行统计和计算，采用相对定量2-△△Ct法进行定量，各反应重复3次，n=5。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HW/BW值比较

Sham组、Model组、BBR组HW/BW值分别为(2.82±0.23)、(4.11±0.33)、(3.62±0.40)g·kg-1，Model组、BBR组较Sham组显著增加(P<0.01)，BBR组较Model组显著减少(P<0.05)。

2.2 小檗碱对压力超负荷大鼠左心室心肌胶原纤维化的影响

Masson染色显示血管和心肌中的胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色(图1)。Sham组、Model组、BBR组CVF值分别为(2.81±1.54)%、(14.95±2.16)%、(12.11±2.19)%，Model组、BBR组较Sham组显著增加(P<0.01)，BBR组较Model组显著减少(P<0.05)。

2.3 小檗碱对压力超负荷大鼠左心室心肌成熟miR-29b及其靶基因表达的影响

与Sham组比较，Model组、BBR组miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)，miR-29b表达水平显著下降(P<0.01)。与Model组比较，BBR组miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)，miR-29b表达水平显著升高(P<0.05)。见图2。

3 讨论

高血压是常见的心血管疾病，约1/3以上高血压患者会出现左心室肥厚和心肌纤维化。左心室肥厚与心脏舒缩功能的下降、冠脉储量的减少等密切相关，是猝死和充血性心力衰竭的主要的危险因素，同样以心脏成纤维细胞(CFs)增殖和细胞外基质(ECM)沉积为特征的心肌纤维化也已被证明在高血压引起的心力衰竭的发病机制中起重要作用[5-6]，故逆转左心室肥厚和心肌纤维化已成为治疗高血压，预防心力衰竭的潜在策略和近年来高血压防治领域的新热点。

miRNAs是一种短链非编码RNA，在转录后水平调节基因的表达。有研究[7-8]显示miRNA可以调节心肌肥大、纤维化，对高血压的发生、发展有重要影响，并可作为高血压潜在的生物标志物和治疗靶点。目前已明确其作用机制主要与TGF-β1/Smad信号通路[9]及肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)介导[10]等密切相关。miR-29b在胚胎组织中几乎不表达，在成熟组织细胞中广泛表达。朱柯等[11]发现扶正化瘀方抗心肌纤维化的作用可能与其抑制AngⅡ诱导的CFs增殖，并促进CFs的凋亡及miR-29b-5p表达有关。也有学者认为MiR-29b通过激活Notch信号通路抑制心肌纤维化和心肌肥厚，保护心肌细胞发展为心肌梗死[12]。

有研究[2,13]发现小檗碱对压力诱导的心肌肥厚有显著的治疗作用，其作用机制和小檗碱通过上调心肌血管内皮细胞miR-29b的表达，促进缺血诱导的血管新生，改善心肌梗死小鼠的心功能有关[14]。本研究采用腹主动脉缩窄法致压力超负荷大鼠心肌肥厚模型证明小檗碱可以显著抑制大鼠压力负荷性心肌肥厚模型心肌肥厚和心肌纤维化。大鼠压力负荷性心肌肥厚模型心肌组织miR-29b水平显著降低，miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA水平明显增加，而小檗碱治疗后可以显著上调其心肌组织miR-29b水平，降低miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA水平，提示小檗碱的抗心肌肥厚和心肌纤维化的机制可能与小檗碱对miR-29b水平的调节有关。这和ZHU等[14]研究结果基本相似，其通过结扎左前降支冠状动脉在小鼠中建立心肌梗死模型，评估血管生成并测定miR-29b的表达，认为小檗碱增加miR-29b表达并促进培养的内皮细胞的增殖和迁移，进而改善心脏功能。故本研究为小檗碱治疗心肌肥厚及纤维化提供了理论依据，为心肌肥厚与纤维化疾病的治疗提供新的治疗靶点、新思路。