田玉生，邹颜阳

(重庆医科大学附属南川人民医院，重庆市南川区人民医院病理科，重庆 408400)

结肠癌是消化系统最常见的肿瘤之一，其发病率居全球第3位。有研究[1]报道，结肠癌患者5年生存率仅约50%。尽管近年来外科手术和放化疗技术取得了很大进展，但是结肠癌患者的死亡率仍居高不下，特别是晚期患者。因此亟需找到用于早期诊断和治疗的新型分子标志物，以提高结肠癌患者的生存率。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种长度大于200个核苷酸、但不具备编码蛋白能力的基因转录产物。越来越多的研究[2]发现，lncRNA与肿瘤的发生和发展密切相关。FAM83H-AS1是近年来发现的一种新型lncRNA，与多种肿瘤有关，如肝细胞癌[3]、胃癌[4]和膀胱癌[5]等。YANG等[6]通过生物信息学分析发现，FAM83H-AS1在结肠癌患者组织中高表达。为进一步分析FAM83H-AS1在结肠癌组织中异常表达的临床意义，本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)和原位杂交法检测了结肠癌组织中FAM83H-AS1的表达水平，并探讨了其与患者临床特征及预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入标准：1)经病理检查证实为结肠癌者；2)术前未接受放疗、化疗或免疫治疗者；3)病例资料完整者；4)家属知情同意者。排除标准：1)伴有其他部位恶性肿瘤者；2)严重的心、肝、肾等脏器功能障碍者；3)伴免疫系统疾病者。

收集2012年6月至2013年6月在重庆市南川区人民医院进行手术治疗的结肠癌患者90例，术中留存90例结肠癌(结肠癌组)及对应的癌旁组织(癌旁组)标本，癌旁组织距离肿瘤边缘≥5 cm，术后病理检查证实无癌组织侵犯[7]。患者年龄48～87岁，平均(67.25±8.29)岁；男49例，女41例；肿瘤直径≤5 cm者40例，>5 cm者50例；左侧结肠51例，右侧结肠癌39例；低分化癌26例，中/高分化癌64例；浸润深度T1/T2 30例，T3/T4 60例；有淋巴结转移9例；TNM分期为Ⅰ期8例，Ⅱ期45例，Ⅲ期20例，Ⅳ期17例。随访终点为患者死亡或2019年5月，随访时间为2～83个月，平均(55.01±26.93)个月。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒(日本TaKaRa公司)；2×SYBR Green PCR Master Mix试剂(美国Invitrogen公司)；原位杂交用预杂交液和封闭液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；Anti-Digoxigenin-POD试剂和地高辛标记探针检测试剂盒(美国罗氏公司)。

1.3 RT-qPCR检测FAM83H-AS1的mRNA表达

用RNA提取试剂盒提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，用2×SYBR Green PCR Master Mix进行RT-qPCR，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。本研究以18S rRNA为内参。用2-△△Ct法计算组织中FAM83H-AS1 mRNA表达水平。引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司设计并合成，FAM83H-AS1和18S rRNA引物序列见表1。

表1 FAM83H-AS1和18S rRNA基因的引物序列

1.4 原位杂交法检测FAM83H-AS1表达水平

组织标本4 mm切片后，常规脱蜡脱水。将探针FAM83H-AS1用杂交液稀释至20 nmol·L-1，滴加于组织切片上，水浴锅中杂交18 h，随后用TI-KS溶液洗涤3次，含牛血清白蛋白封闭液封闭25 min。杂交后用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与FAM83H-AS1结合复合物，TSA放大系统(北京普华量宇科技有限公司)增强原位杂交反应信号，NBT/BCIP显色，最后用中性树胶封片。染色结果由两专业人士独立进行双盲评分：染色强度评分：0分(无染色)，1分(浅黄色染色)，2分(棕色染色)，3分(深棕色染色)。阳性细胞数计分：0(<5%染色细胞)、1(5%～25%染色细胞)、2(25%～50%染色细胞)、3(50%～75%染色细胞)和4(>75%染色细胞)。FAM83H-AS1的表达水平为阳性细胞数计分乘以染色强度评分[8]，0表示阴性(-)，1～3表示弱阳性(+)，4～8表示阳性()，9～12表示强阳性()。以0～3分为低表达；4～6分为高表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。正态计量数据采用(均数±标准差)表示，组间比较用t检验；计数资料采用百分率(%))表示，组间比较用χ2检验，等级资料采用非参数秩和检验；用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率比较采用log-rank检验；采用COX多因素回归分析FAM83H-AS1表达与结肠癌患者临床特征及总体生存率的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组FAM83H-AS1的表达

RT-qPCR检测结果显示，结肠癌组FAM83H-AS1mRNA的相对表达量为(4.48±1.38)，明显高于癌旁组(1.18±0.24)，2组比较差异有统计学意义(t=22.350，P<0.001)。见图1。原位杂交法检测结果显示，FAM83H-AS1主要表达于细胞核，在细胞浆中也有表达(图2)，而且结肠癌组大多呈强阳性表达；与RT-qPCR检测结果一致，结肠癌组FAM83H-AS1的阳性表达率明显高于癌旁组(Z=-7.645，P<0.001)。见表2。

表2 2组FAM83H-AS1表达的比较 例

2.2 FAM83H-AS1表达与结肠癌患者临床特征的关系

Spearman相关性分析显示，FAM83H-AS1表达水平与结肠癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈正相关(r=0.342、0.376、0.410、0.612，P<0.05)。见表3。COX多因素回归分析结果显示，分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期是影响结肠癌中FAM83H-AS1表达的独立因素(P<0.05)。见表4。

表3 FAM83H-AS1表达与结肠癌患者临床特征的关系

表4 COX多因素回归分析FAM83H-AS1表达与结肠癌患者临床特征的关系

2.3 FAM83H-AS1表达与结肠癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析结果显示，FAM83H-AS1高表达的结肠癌患者的5年生存率为26.85%，明显低于低表达患者(80.36%)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。COX多因素回归分析结果显示，年龄、FAM83H-AS1表达水平、浸润深度和淋巴结转移是影响结肠癌患者总体生存率的独立因素(P<0.05)，且年龄越高、FAM83H-AS1表达水平越高、肿瘤浸润越深和淋巴结越易发生转移，患者总体生存率越低。见表5。

表5 FAM83H-AS1表达与结肠癌患者总体生存率的关系

3 讨论

结肠癌是消化系统最常见的肿瘤之一，确诊时多数患者已为进展期，预后较差[1]。因此寻找潜在的分子生物学标志物来提高结肠癌患者的诊断有着重要意义。近年，lncRNA对肿瘤诊断和治疗的价值引起了国内外学者的重视。其中，FAM83H-AS1是近年来发现的一种新型lncRNA，与多种肿瘤的发生和发展密切相关[3-5,9]。

本研究发现，FAM83H-AS1在结肠癌组织中的表达水平较癌旁组织更高，这与YANG等[6]报道一致。本研究还发现，FAM83H-AS1的表达水平与结肠癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关，提示FAM83H-AS1与结肠癌的进展密切相关。在其他肿瘤组织中已有类似报道。例如，在卵巢癌的研究中，DOU等[10]发现FAM83H-AS1可以促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭，并且其表达水平与卵巢癌大小、病理分期和淋巴结转移有关。但是，与本研究结果不同的是，YANG等[11]发现FAM83H-AS1表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移和TNM分期均无关。这些研究结果的差异性可能与组织样本量、肿瘤的类型和患者的年龄等因素有关，需要今后进一步分析。

有研究[12-13]报道，年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤浸润程度、淋巴结转移和TNM分期等与结肠癌患者预后有关。本研究发现，FAM83H-AS1异常高表达与结肠癌患者的不良预后有关。FAM83H-AS1高表达的结肠癌患者的总体生存率为26.85%，明显低于低表达水平患者(80.36%)。另外多因素分析结果也显示，FAM83H-AS1高表达是结肠癌患者不良预后的独立因素。本研究结果与既往大多数研究[4,11]一致，例如DA等[4]发现，FAM83H-AS1高表达与胃癌患者的总体生存率和中位生存时间低有关。YANG等[11]也发现，FAM83H-AS1高表达的患者生存率明显低于低表达患者。

有研究[14]显示，FAM83H-AS1可能通过靶向Notch信号通路促进结直肠癌细胞的增殖。FAM83H-AS1的致癌作用也可能与MET/EGFR信号通路、E6-p300信号通路和MYC信号通路等有关[15-17]。FAM83H-AS1在结肠癌中通过何种机制发挥其促癌，需要更进一步的研究。

综上所述，本研究结果发现，FAM83H-AS1在结肠癌组织中呈异常高表达，其表达水平与癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和生存预后有关，而且是这些临床参数的独立影响因素。这些结果表明FAM83H-AS1可能在结肠癌的发生和发展中起着致癌作用。但FAM83H-AS1如何促进结肠癌发生发展，至今尚未明确，这可能是未来进一步研究的方向。