刘婷婷 吕宗德 李凤玲 白梦茹

（南京市畜牧兽医站，江苏南京 210012）

H5亚型高致病性禽流感和H7N9一直威胁着养禽业的健康发展，为了更好地应对疫情防控形势，有效预防疫病的发生，国内相关的强制免疫政策也在不断地做出调整。2017年秋季开始，开始使用重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗，在H5亚型禽流感强制免疫的基础上增加了H7亚型的强制免疫，2019年春季，又将重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1Re-8株+H7N9H7-Re1株）变更为重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9H7-Re2株）（以下简称禽流感H5+H7三价苗）。本研究主要通过对蛋鸡H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7-Re2三种母源抗体的检测及接种疫苗后免疫抗体水平的监测，为禽流感H5+H7三价苗免疫程序的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

海兰蛋鸡400羽分两组，其中200羽为母源抗体组，另外200羽为免疫组。母源抗体组在28日龄前不注射疫苗，也不使用任何药物和添加剂；免疫组分别在15日龄、40日龄、80日龄、120日龄（开产前）、240日龄、360日龄采用禽流感H5+H7三价苗注射免疫，其中首免采用0.3ml颈部皮下注射，5周龄以后采用0.5ml胸部肌肉注射。

1.2 疫苗与检测试剂

禽 流 感 病 毒H5亚 型（Re-11株）、H5亚 型（Re-12株）、H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，批号均为2019004，有效期分别是 20210807、20210809、20210905。禽流感 H5+H7三价苗购自乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂，批号为兽药临字160132319。

1.3 样品采集

母源抗体组分别在1日龄、7日龄、14日龄、21日龄及28日龄随机采集20份血样，每份血量不少于2ml，1日龄、7日龄时采用心脏采血，采血后的鸡只淘汰，14日龄开始采用翅静脉采血。

免疫组，根据免疫时间按一定的时间间隔进行随机采样，每次20份，每份不少于2ml。

1.4 母源抗体监测

分别对母源抗体组的5批样品进行禽流感病毒H5亚型（Re-11株）、H5亚型（Re-12株）、H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验，该试验使用一次性96孔V型微量反应板，具体操作方法按照国家标准《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T18936-2003）进行。检测过程中分别设阳性对照、空白对照，并对配置的4单位病毒进行回归试验。结果判定标准按照≥4log2为合格。

1.5 免疫抗体监测

免疫组分别在28日龄、35日龄、40日龄、47日龄、80日龄、120日龄、240日龄、360日龄及500日龄时采样，进行禽流感病毒H5亚型（Re-11株）、H5亚型（Re-12株）、H7亚型（H7-Re2株）的免疫抗体检测。检测方法同1.4。

2 结果与分析

2.1 禽流感母源抗体的消长

试验结果表明，母源抗体组的H5（Re-11株、Re-12株）和H7亚型三种母源抗体的整体消长趋势基本一致。抗体效价均在1日龄时最高，之后随着日龄的增长抗体效价逐渐下降。1-7日龄下降趋势较缓，之后呈明显下降趋势，至14日龄，抗体效价平均值已降至4log2以下，28日龄母源抗体基本为零。此外，三种母源抗体的变异系数随着日龄的增加逐渐增大。试验结果见表1，图1。

表1 母源抗体组禽流感H5Re-11、H5Re-12和H7-Re2母源抗体消长

表2 免疫组禽流感H5Re-11、H5Re-12和H7-Re2免疫抗体水平

图1

2.2 禽流感H5+H7三价苗免疫后抗体效价的走势

免疫组于14日龄首免后，H5（Re-11株、Re-12株）和H7亚型三种免疫抗体效价的整体增长趋势基本一致，随着日龄的增加平均抗体效价逐渐提高。首免后14天，抗体效价提高并不显著，21天时合格率才达标，但平均抗体效价仍没有达到很高水平。40日龄时二免，免疫1周后出现了抗体效价略微下降的趋势，之后迅速上升并维持在一个较高水平。此外，随着免疫抗体效价的提高，变异系数逐渐变小。试验结果见表2，图2。

图2

3 讨论

3.1 母源抗体组

本试验中，母源抗体的消长规律表明，雏鸡出壳后具有较高的抗体水平，足以保护雏鸡抵抗禽流感病毒H5、H7亚型的侵袭。7日龄内，母源抗体水平衰减速度缓慢，可能与体内的卵黄囊可以继续提供抗体有关[1]。7～14日龄，伴随着卵黄囊的消失，体内的母源抗体水平急剧下降[2]，至14日龄时，抗体效价已经不能为鸡群提供良好的保护力，在不免疫的状态下，28日龄时，鸡体内的母源抗体基本消失。这为我们确定首免日龄提供了可靠的依据，海兰蛋鸡禽流感H5+H7三价苗的首免日龄不要太迟，最好控制在14日龄前后。

3.2 免疫组

鸡群在14日龄首免，免疫14d后抗体效价有所提高，但是合格率达不到70%，免疫21天时才能够提供较好的保护力。40日龄二免，二免后1周，抗体效价出现了一个短暂的下降，这主要是由于疫苗进入鸡体后会中和掉部分抗体[3]，在鸡体抗体效价没有达到较高水平时会呈现出一个略微的跌落。跌落之后，抗体效价呈现明显上升趋势，并一直维持在较高水平，而且变异系数也控制在很小的范围内。由此可见，该免疫程序的免疫效果良好，可以为鸡群提供良好的保护力。唯一需要注意的是首免后免疫抗体水平增长缓慢、曲折，14日龄-28日龄前后以及二免后1周都属于免疫保护力薄弱期，建议在此期间加强饲养管理，控制好舍内温、湿度，尽可能避免疫病发生的各种风险因素。