贾 萌，贺聪莹，周志云，杨晓莉

（陕西省食品药品监督检验研究院·药品微生物检测技术重点实验室，陕西 西安 710065）

奥硝唑为第3 代硝咪唑类衍生物，其抗菌机制是通过分子中的硝基在无氧或少氧环境中被还原成氨基，从而抑制病原细胞DNA 的合成，并使已合成的DNA 降解，破坏DNA 的双螺旋结构，阻断转录及复制，使病原细胞彻底死亡［1-2］。其5 位上的硝咪唑环决定了这类药物具有较强的抗菌和抗原虫作用，尤其是具有较强的抗厌氧菌作用，如本研究中涉及的生孢梭菌。经调研，目前国内医药市场及西安市内三级甲等医院［3］所用奥硝唑注射液的规格为每瓶100 mL ∶0.5 g，每支10 mL ∶0.5 g或每支5 mL ∶0.5 g，而每支3 mL ∶0.5 g 规格的奥硝唑注射液将来可能会在西安市内各大医院使用，故对该规格奥硝唑注射液无菌检查方法的研究势在必行。从该药新规格处方配比来看，其药效和稳定性都大大提高，说明其抑菌性更强，无菌检查方法的建立难度也随之提升。本研究中拟探索出更科学高效的小规格高浓度奥硝唑注射液的无菌检查方法，以便后期对医药企业建立该规格样品的无菌检查方法时提供参考。现报道如下。

1 仪器、试药与菌株

1.1 仪器

Steritest Symbio LFH 型智能集菌仪（德国Merck 公司）；SX-500 型蒸汽灭菌器（Tomy 公司）；LRH-250 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；WGP-600型隔水式电热恒温培养箱（重庆万达实验仪器厂）；HFsafe-760S 型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；PB-10 pH 计（德国Sartorius 公司）；涡旋振荡仪（德国IKA 公司）；单项溶解组件（双针头溶解组件）、KSF220 型一次性全封闭集菌培养器［4］均购自浙江泰林生物技术设备有限公司。

试药：奥硝唑注射液（规格为每支3 mL∶0.5g 供试品，研制品）；硫乙醇酸盐流体培养基（FTM，批号为180830），胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号为180524），胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号为180427），沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，批号为180731），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号为180518），0.1%蛋白胨水溶液（批号为181028），均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.3 菌株

金黄色葡萄球 菌Staphylococcus aureus〔CMCC（B）26003〕，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa〔CMCC（B）10104〕，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis〔CMCC（B）63501〕，生孢梭菌Clostridium sporogenes〔CMCC（B）64941〕，大肠埃希菌Escherichia coli〔CMCC（B）44102〕，白色念珠菌Candida albicans〔CMCC（F）98001〕，黑曲霉Aspergillus niger〔CMCC（F）98003〕，均购自中国医学细菌保藏管理中心，工作用菌株为第3代［5］。

2 方法与结果

2.1 试验菌制备

分别将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种于TSB 培养基中，35 ℃条件下培养24 h；生孢梭菌接种于FTM 培养基中，35 ℃条件下培养24 h；白色念珠菌接种于SDB 培养基，25 ℃条件下培养48 h；黑曲霉接种于SDA 培养基中，25 ℃条件下培养7 d。上述菌株均分别加入含0.05%聚山梨酯80 的无菌氯化钠溶液，洗脱孢子，采用10 倍稀释法制得每1 mL 含菌数小于100 cfu 的菌悬液［5-6］。加入菌株稀释级及含菌数计数结果见表1。

表1 菌株稀释级及含菌计数结果

2.2 无菌方法适用性研究

试验Ⅰ组：取供试品20 支，无菌操作，开启集菌仪，先用0.1%蛋白胨水溶液50 mL 润洗滤膜，再将供试品导入集菌过滤器内，每支供试品接入每种培养基的量为1.5 mL（即半量接入），每膜接种供试品30 mL（20 支）。按薄膜过滤法过滤，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗5 次，每次100 mL，最后1 次冲洗液预留少许加入含菌量小于100 cfu 的试验菌株，过滤，在每个培养管内灌注培养基100 mL。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭菌接种于FTM 培养基中，35 ℃条件下培养5 d，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉接种于TSB 培养基中，25 ℃条件下培养5 d［7］。

试验Ⅱ组：仅冲洗液中加入0.5%聚山梨酯80，其余操作同试验Ⅰ组［7］。

试验Ⅲ组：仅最终的FTM 和TSB 培养基中加入0.5%聚山梨酯80，其余操作同试验Ⅰ组。

试验Ⅳ组：在冲洗液及最终的FTM 和TSB 培养基中加入0.5%聚山梨酯80，其余操作同试验Ⅰ组。

试验Ⅴ组：仅冲洗液中加入1%聚山梨酯80，其余操作同试验Ⅰ组。

试验Ⅵ组：冲洗液中加入1%聚山梨酯80，冲洗后再用0.1%蛋白胨水溶液200 mL（每次50 mL）冲洗4 次，去除泡沫，其余操作同试验Ⅰ组。

试验Ⅶ组：仅冲洗次数增至8 次，其余操作同试验Ⅵ组。

试验Ⅷ组：取供试品20 支，无菌操作，开启集菌仪，用无菌的单项溶解组件将供试品（每支半量）导入含1%聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液（每瓶200 mL）中，混匀，待用。用0.1%蛋白胨水溶液润膜，将上述制备好的稀释样液按薄膜过滤法过滤，用含1%聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液冲洗5 次，每次100 mL，再用0.1%蛋白胨水溶液200 mL 冲洗，4 次，每次50 mL，去除泡沫，其余操作同试验Ⅰ组。

阳性对照组：不加入供试品，以生孢梭菌为阳性对照菌，操作同试验Ⅰ组。

阴性对照组：取相应稀释液、冲洗液同试验Ⅰ组操作，不加入供试品和试验菌。

2015年版《中国药典（四部）》通则1101 无菌检查法项下规定，与阴性对照组培养管比较，各试验组与阳性对照组的试验菌均生长良好或培养管混浊，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计，按此法进行供试品的无菌检查。若试验组的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明该供试品的该检验量在该检验条件下的抑菌作用未消除，应采取增加冲洗量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，重新进行方法适用性试验［5-6］。

2.3 试验结果

结果见表2。阳性对照组中均生长良好（全部培养管均混浊）；试验Ⅰ组中6 种试验菌株的培养管中均未出现混浊；试验Ⅱ组和试验Ⅲ组中白色念珠菌和黑曲霉培养管均混浊，而其余菌均未生长；试验Ⅳ组中枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉培养管均混浊，其余菌均未生长；试验Ⅴ组中由于过滤过程中产生泡沫，最后灌注培养基后金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭菌培养管不易观察，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉混浊很明显；试验Ⅵ组中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉培养管均混浊，生孢梭菌培养管在第5 天出现混浊，浊度较阳性对照组轻；试验Ⅶ组培养管均混浊（生孢梭菌培养管第3 天变混浊），浊度与阳性对照组相近；试验Ⅷ组培养管均混浊（生孢梭菌培养管第2 天混浊）。

表2 小规格（3 mL ∶0.5 g）奥硝唑注射液无菌检查方法学试验结果

3 讨论

抗菌药物无菌检查方法学的建立重点在于抑菌性的去除，而不同类别的抗菌药物由于其药理机制不同，对不同敏感菌的抑制作用也各不相同［8］。不同规格的同种抗菌药物其抑菌作用也千差万别［9］，建立合适的无菌检查方法对于医药企业的检验工作可起到事半功倍的效果。本次供试品规格属于新药，其对厌氧菌的抑制能力强于其他规格。

试药处方：本次供试品处方仅含奥硝唑主药、无水乙醇及丙二醇［2］，处方中无水乙醇及丙二醇可增强奥硝唑在有机溶剂中的稳定性。丙二醇是一种无色黏稠状透明液体，在进行薄膜过滤法无菌检查方法学研究时，对比了直接吸取过滤和稀释供试品后再过滤对试验过程及结果的影响［10］，经过8 组试验结果的确认，最终选择稀释法进行样品的前处理，既降低了供试品的抑菌性，又方便了过滤。

中和剂选择：奥硝唑为第3 代硝咪唑类化合物，其分子结构中的硝咪唑环决定了其抑菌能力，5 位上硝咪唑环中的氮原子属季铵化合物，铵根离子（NH4+）中的4 个H 均被其他基团替代。由于其含有季铵结构，可选用聚山梨酯类非离子表面活性剂为中和剂。聚山梨酯80 是多元醇型非离子表面活性剂，亲水性强，常用作增溶剂和稳定剂［11］。经试验确定，中和剂选择聚山梨酯80。

中和剂用量：在使用过程中，由于薄膜过滤器内部压力和聚山梨酯80 所处环境温度的影响（当环境温度低于其自身昙点温度时会有不稳定的起泡现象发生），加入中和剂的冲洗液在过滤过程中有较多泡沫产生［7］，为了后期便于观察，最后需用不含聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液冲掉泡沫的干扰。试验过程中比较了不加中和剂、加入0.5%聚山梨酯80 和加入1%聚山梨酯80 对试验结果的影响，结果显示，冲洗液中加大中和剂的浓度可适当降低奥硝唑的抑菌性，但聚山梨酯80 的含量超出1%后滤管内会产生大量泡沫，导致不易观察和操作，因此在无菌检查方法的建立中，选用冲洗液中和剂的用量［12］为1%聚山梨酯80。试验Ⅶ组与试验Ⅷ组的结果均满足奥硝唑注射液无菌检查方法学的要求，但试验Ⅶ组在样品黏稠问题上未得到合理解决，试验过程中由于样品黏稠不易过滤，极易导致交叉污染的风险，且2015年版《中国药典（四部）》通则1101 无菌检查法项下薄膜过滤法部分明确规定，每张滤膜每次冲洗量一般为100 mL，且总冲洗量不得过1 000 mL，以避免滤膜上的微生物受损［5-6］。因此，选择试验Ⅷ组条件为最终方案。

综上所述，本研究中建立的稀释-中和剂薄膜过滤法可对小规格高浓度（3 mL ∶0.5 g）奥硝唑注射液进行无菌检查。