周施雨， 钱志萍， 曹东东， 於俊杰， 游蕤翔， 戴锡玲，①

(1. 上海师范大学： a. 生命科学学院， b. 环境与地理科学学院， 上海 200234； 2. 上海市第一人民医院， 上海 200080)

近年来，蕨类植物的有效成分研究备受人们关注，药用蕨类植物含有黄酮类、酚酸类、萜类、生物碱和多糖等化学成分[1]；其多糖除了参与构成细胞壁和储藏营养外，还具有提高免疫力、抗菌和抗癌的功效[2-3]。

阴地蕨〔Botrychiumternatum(Thunb.) Sw.〕隶属于阴地蕨科(Botrychiaceae)阴地蕨属(BotrychiumSw.)，为传统药用植物，全草入药，具有清热解毒、平肝息风、止咳、止血和明目去翳的功效[4-5]。近年来，已有学者对阴地蕨中的黄酮类和酚酸类成分的生物活性进行了研究[6-8]，但对于其多糖成分的生物活性尚缺乏全面的了解，仅曹剑锋等[9]就阴地蕨多糖对小鼠结肠癌、红白血病以及小鼠血液细胞等生物活性进行了研究。

鉴于此，作者采用水提醇沉法从阴地蕨全草中提取粗多糖，并分析其抑菌和抑制肿瘤细胞增殖的作用，以期探明阴地蕨多糖成分的生物活性，为阴地蕨多糖的开发和利用提供基础研究数据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试阴地蕨全草于2016年12月采自湖北随州，采集生长状况良好的植株，晾干后切段，用粉碎机研磨成粉末，供试。大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)均由上海市第一人民医院检验科提供；人宫颈癌细胞(Hela)和人肺癌细胞(A-549)均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制以及粗多糖提取和多糖含量测定 配制质量浓度0.2 mg·mL-1葡萄糖标准液并进行梯度稀释，采用苯酚-硫酸法[10]测定波长490 nm处吸光度，绘制葡萄糖标准曲线Y=21.552 0X-0.453 8(R2=0.963 3，线性范围为5.840 0～58.380 0 μg·mL-1)。

称取阴地蕨全草粉末20 g，采用水提醇沉法[11]提取粗多糖。将阴地蕨粗多糖配制成质量浓度0.511 mg·mL-1待测溶液，同法测定波长490 nm处吸光度，并根据葡萄糖标准曲线计算多糖含量。

1.2.2 抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)测定 大肠杆菌菌液解冻后接种在无菌LB培养液中，于37 ℃恒温培养箱中振荡培养24 h，用无菌LB培养液稀释成6×106CFU·mL-1菌液，待用。刮取金黄色葡萄球菌菌苔，接种在无菌TSB培养液中，在培养液中加入适量的质量体积分数0.9%NaCl溶液，于37 ℃恒温培养箱中静置培养24 h，用无菌TSB培养液稀释至6×106CFU·mL-1菌液，待用。采用纸片扩散法[12]分别制备含大肠杆菌和含金黄色葡萄球菌的平板。

配制质量浓度分别为0.412、1.648和6.592 mg·mL-1的粗多糖无菌溶液，分别吸取20 μL滴于6块平板的滤纸片上，并以质量浓度相同的卡那霉素作为各自的阳性对照，以无菌超纯水作为空白对照；将培养皿置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察并采用直尺(精度1 mm)测量抑菌圈直径。实验重复3次。

配制质量浓度分别为0.103、0.206、0.309、0.412和0.515 mg·mL-1的粗多糖无菌溶液，采用上述方法观察并测量抑菌圈直径，确定MIC值[13]。实验重复3次。

1.2.3 肿瘤细胞相对存活率测定 配制含质量体积分数10%胎牛血清和质量体积分数1%青霉素-链霉素的DEME培养液，并接种A-549和Hela细胞，然后置于体积分数5%CO2、温度37 ℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2 d更换1次细胞培养液并进行传代。分别取对数生长期的A-549和Hela细胞，按最佳铺板密度接种100 μL细胞悬液至96孔培养板中，分别加入质量浓度4.120、8.240、16.480、32.960和65.920 μg·mL-1粗多糖溶液，阳性对照组加入质量浓度相同的喜树碱，空白对照组不加粗多糖溶液，本底组不接种细胞；将培养板置于37 ℃细胞培养箱中培养48 h；然后每孔加入质量浓度5 mg·mL-1MTT 20 μL，继续培养4 h后加入100 μL三联液(包含体积分数10%SDS、体积分数5%异丁醇和0.01 mol·L-1HCl)，37 ℃培养过夜；培养结束后用全波长式微孔板酶标仪(瑞士Tecan公司)测定波长570 nm处吸光度(OD)，根据公式“相对存活率=〔(OD样品组-OD本底组)/OD空白对照组〕×100%”计算各组肿瘤细胞的相对存活率。实验重复3次。

1.3 数据处理和分析

使用predict函数进行点估计，取95%置信区间构造区间估计，分别估算阴地蕨粗多糖对A-549和Hela细胞的半抑制浓度(IC50)。采用R软件进行数据处理。

2 结果和分析

2.1 阴地蕨全草的粗多糖得率及多糖含量

测定结果表明：阴地蕨全草的粗多糖得率为7.05%；粗多糖中多糖含量为20.60%，经过换算可知阴地蕨全草的多糖含量为1.45%。

2.2 阴地蕨粗多糖的抑菌作用

不同质量浓度阴地蕨粗多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表1。结果表明：阴地蕨粗多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，且对大肠杆菌的抑制作用略强于金黄色葡萄球菌；随着粗多糖质量浓度的提高，抑菌圈直径均逐渐增大，表明阴地蕨粗多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用具有一定的浓度依赖性；当粗多糖质量浓度达到6.592 mg·mL-1时，抑菌作用最强。此外，阴地蕨粗多糖的抑菌作用明显小于质量浓度相同的卡那霉素(阳性对照)。

表1 阴地蕨粗多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径1)Table 1 Inhibitory zone diameter of crude polysaccharides from Botrychium ternatum (Thunb.) Sw. to Escherichia coli and Staphylococcus aureus1)

进一步测定结果表明：阴地蕨粗多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为0.206和0.309 mg·mL-1，说明阴地蕨粗多糖对于大肠杆菌的抑制作用优于金黄色葡萄球菌。

2.3 阴地蕨粗多糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用

经不同质量浓度阴地蕨粗多糖处理后A-549和Hela细胞的相对存活率见表2。结果表明：随着阴地蕨粗多糖质量浓度的提高，A-549和Hela细胞的相对存活率均逐渐降低，当粗多糖质量浓度达到65.920 μg·mL-1时，A-549和Hela细胞的相对存活率分别为62.20%和65.80%，表明阴地蕨粗多糖质量浓度越高，对A-549和Hela细胞增殖的抑制作用越强，呈现一定的浓度依赖性。此外，阴地蕨粗多糖对A-549和Hela细胞增殖的抑制作用明显小于质量浓度相同的喜树碱(阳性对照)。

表2 经不同质量浓度阴地蕨粗多糖处理后A-549和Hela细胞的相对存活率Table 2 Relative survival ratio of A-549 and Hela cells treated by crude polysaccharides from Botrychium ternatum (Thunb.) Sw. at different mass concentrations

predict函数计算结果显示：阴地蕨粗多糖浓度与A-549和Hela细胞的相对存活率呈良好的线性关系，线性方程分别为Y=445.682 4-6.133 9X(R2=0.984 5)和Y=240.221 7-2.619 7X(R2=0.980 3)；阴地蕨粗多糖对A-549和Hela细胞的半抑制浓度分别为138.90和109.23 μg·mL-1。由此可知，阴地蕨粗多糖对Hela细胞增殖的抑制作用略强于A-549细胞，且Hela细胞对阴地蕨粗多糖的浓度变化更敏感。

3 讨论和结论

阴地蕨全草的多糖含量达1.45%，接近欧洲蕨〔Pteridiumaquilinum(Linn.) Kuhn〕全草的多糖含量，但高于乌蕨〔Stenolomachusana(Linn.) Ching〕、华南毛蕨〔Cyclosorusparasiticus(L.) Farwell.〕和井栏边草(PterismultifidaPoir.)等蕨类植物全草的多糖含量[2]。乌蕨、蜈蚣蕨(PterisvittataLinn.)和华南毛蕨等蕨类植物的多糖对大肠杆菌、变形杆菌(Proteusvulgaris)和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用[2]，而阴地蕨粗多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用，说明蕨类植物多糖具有广谱抗菌效果。阴地蕨粗多糖对大肠杆菌的抑制效果强于金黄色葡萄球菌，因而，可初步判断阴地蕨粗多糖对革兰氏阴性菌的抑制效果更强，这也佐证了阴地蕨对肠炎病原菌具有明显的抑制效果[3]。阴地蕨粗多糖对A-549和Hela细胞的增殖均有一定的抑制作用；从半抑制浓度看，阴地蕨粗多糖对Hela细胞增殖的抑制作用强于A-549细胞，且Hela细胞对阴地蕨粗多糖的浓度变化更敏感。

研究结果表明：阴地蕨粗多糖的抑菌和抑制肿瘤细胞增殖的作用均呈现一定的浓度依赖性，且均随其质量浓度提高而增强，但均明显小于各自的阳性对照，说明虽然阴地蕨粗多糖呈现出一定的抑菌和抑制肿瘤细胞增殖的活性，但其药用疗效的开发有待更加科学深入的研究。