姚国敏，古丽努尔·买买提，李 蓉，邓 颖，焦 聪

0引言

视网膜属于中枢神经系统，是人体内最具代谢活性的组织之一[1]。视网膜的高能量需求是由于它是一个将光能转化为神经元信号的高度敏感和高效的系统，这也是视网膜比其他组织更快消耗氧气的原因[2]。因此，在能量需求增加的时候，氧气成为视网膜中最有限的代谢物之一。视网膜对缺氧很敏感，在多种视网膜疾病中，缺氧和/或缺血扮演了重要的病因学角色，如视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、青光眼、年龄相关性黄斑变性或高海拔视网膜病变[3]。氧化应激是指活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生与内源性抗氧化系统清除活性氧的能力之间的不平衡。自由基和活性氧通过氧化脂质、蛋白质和核酸而对细胞膜、DNA和其他细胞结构造成不可逆损伤，引起细胞凋亡或细胞死亡，并由大分子损伤引起细胞变性和神经变性[4]。研究证实，缺氧导致的氧化应激在缺血性视网膜疾病的发病机制中起重要作用[5]。

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活力蛋白质，也是分泌最多的脂肪因子。研究表明，脂联素具有改善机体胰岛素抵抗、调节脂质代谢、重塑受损血管和抑制动脉粥样硬化保护心血管系统、抗氧化应激及抗炎等多种生理功能[6]。脂联素及其受体在人眼组织中广泛表达，在视网膜中可以检测到脂联素的表达，而脂联素受体位于不同的视网膜细胞中[7]。越来越多的证据表明，脂联素通过与受体结合发挥作用，激活下游分子通路，在多种疾病中具有神经保护作用[7]。缺乏脂联素可能导致视网膜新生血管，而脂联素通路的激活可能恢复能量代谢，从而抑制视网膜病变代偿性的病理性新生血管形成[8]。既往研究显示，脂联素可减轻小鼠氧诱导视网膜病变模型中视网膜无血管区面积的形成和病理性新生血管的生成，但对于其具体机制尚不完全明确[9]。基于此，我们以恒河猴脉络膜/视网膜内皮(RF/6A)细胞为研究对象，进一步观察脂联素对缺氧条件下视网膜血管内皮细胞活性和凋亡的影响并探讨其具体机制。

1材料和方法

1.1材料恒河猴RF/6A细胞系(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。主要试剂：重组人脂联素(美国BioVision公司);噻唑蓝(MTT)试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；ROS检测试剂盒-DCFH-DA(西安科昊生物科技有限公司)；兔单抗Bax、兔单抗Bcl-2(美国 Cell signaling 公司)。主要仪器设备：全自动酶标仪(美国Thermo scientific公司，Multiskan MK3型)；激光共聚焦荧光显微镜(日本Nikon公司，C2型)；荧光酶标仪(美国Bio-Tek公司，ELX800型)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将RF/6A细胞置于37℃、体积分数5% CO2、95%湿度的培养箱中常规培养，在含有胎牛血清(体积分数10%)和抗生素的DMEM培养液中常规培养。取对数生长期、生长状态良好的细胞进行实验。

1.2.2实验分组及模型建立将细胞按照随机对照原则分为五组，对照组(加入PBS液)、缺氧损伤组、缺氧损伤+脂联素组(按照脂联素浓度分为5、50、100μmol/L三组)，用以选择合适的脂联素作用浓度进行后续研究。然后将细胞按照随机对照原则分为三组，对照组(加入PBS液)、缺氧损伤组、缺氧损伤+脂联素(50μmol/L)组。缺氧模型的建立参照文献[10]的方法，细胞接种24h后，对照组换新鲜培养液，缺氧损伤组换CoCl2(作用浓度125μmol/L)工作液，继续培养24h。脂联素处理组在细胞接种24h后，构建缺氧模型前加入相应浓度的脂联素作用6h。

1.2.3细胞活力检测采用MTT法检测细胞活力。取对数生长期细胞，弃上清液，用胰蛋白酶消化后，加入含体积分数10%的DMEM培养液，制成细胞浓度为5×104个/mL的细胞悬液。取200μL 接种于96孔板，培养板置于37℃、体积分数5% CO2及饱和湿度培养箱中孵育24h，弃去原培养液，按上述方法分为5组，每组设置6个复孔，在完成培养后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，置于培养箱中继续孵育4h，弃去各孔培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡15min，使结晶物充分溶解。用自动酶标仪在490nm波长处测定每孔的吸光度值(optical density，OD)。每组重复检测3次。细胞活力(%)=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.2.4 Bax、Bcl-2蛋白表达检测采用Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。各组 RF/6A细胞用PBS清洗后进行细胞裂解，提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。经SDS-PAGE分析，半干转移法转至PVDF膜，用50g/L脱脂牛奶室温封闭1h。分别加入稀释的兔抗Bax、Bcl-2抗体及β-actin抗体(1∶1000)，4℃孵育过夜。次日，TBST 洗膜10min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶2000)，室温孵育1h；TBST 洗10min×3次，后用ECL化学发光试剂盒在Tanon凝胶图像处理系统显影，计算Bax和Bcl-2的相对蛋白表达。

1.2.5细胞内ROS的检测各组细胞以每孔1×106个接种于6孔板，处理结束后，加入DCFH-DA探针(10μmol/L)孵育90min，用PBS漂洗2次，然后用温无血清培养基继续培养30min，置于荧光显微镜下观察拍照，荧光酶标仪读取各组荧光强度。

统计学分析：实验结果采用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度脂联素对缺氧损伤RF/6A细胞活力的影响MTT结果显示，对照组、缺氧损伤组、缺氧损伤+5μmol/L脂联素组、缺氧损伤+50μmol/L脂联素组、缺氧损伤+100μmol/L脂联素组的细胞活力分别为100.05%±3.34%、54.28%±4.16%、63.65%±2.95%、78.00%±5.10%、75.48%±6.56%，五组之间细胞活力比较差异有统计学意义(F=42.03，P<0.001)。与对照组相比，缺氧损伤组和缺氧损伤+脂联素(5、50、100μmol/L)组细胞活力均下降(t=14.85、14.13、6.26、5.78，均P<0.01)。与缺氧损伤组相比，缺氧损伤+脂联素(5、50、100μmol/L)组细胞活力均显著增加(t=-3.18、-6.24、-4.73，均P<0.05)，提示脂联素对缺氧损伤的RF/6A细胞存活具有促进作用。与缺氧损伤+5μmol/L脂联素组相比，50、100μmol/L脂联素组细胞活力均增加(t=-4.21、-2.84，均P<0.05)，但50μmol/L较100μmol/L脂联素预处理的细胞活力无明显变化，差异无统计学意义(t=0.52，P>0.05)，提示50μmol/L脂联素是较为合适的保护作用浓度(图1)。因此，本研究选择后续实验中脂联素的作用浓度为50μmol/L。

图1 各组RF/6A细胞活力比较

2.2脂联素对缺氧损伤的RF/6A细胞凋亡蛋白表达的影响Western blot结果显示，对照组、缺氧损伤组、缺氧损伤+脂联素组细胞凋亡蛋白Bax相对表达水平分别为0.21±0.04、0.79±0.03、0.38±0.04；Bcl-2相对表达水平分别为0.17±0.04、0.42±0.03、0.81±0.03；Bcl-2/Bax分别为0.84±0.04、0.53±0.03、2.11±0.14。三组之间Bcl-2/Bax比较差异有统计学意义(F=294.80，P<0.001)。与对照组相比，缺氧损伤组细胞Bcl-2/Bax表达下调(t=11.56，P<0.001)，缺氧损伤+脂联素组细胞Bcl-2/Bax表达上调(t=-15.32，P<0.001)；与缺氧损伤组相比，缺氧损伤+脂联素组细胞Bcl-2/Bax表达上调(t=-19.34，P<0.001，图2)。

图2 各组RF/6A细胞表达Bax及Bcl-2蛋白条带及统计学比较

2.3脂联素对缺氧损伤的RF/6A细胞内ROS水平的影响荧光染色结果显示，对照组细胞在荧光显微镜下可见微弱荧光；而CoCl2诱导缺氧后细胞内可见到较强的荧光，说明缺氧损伤可使RF/6A细胞内ROS生成增多，引起细胞内的氧化应激反应；但使用脂联素预处理后RF/6A细胞内的荧光强度较缺氧损伤组明显减弱，说明脂联素可减少CoCl2诱导的缺氧损伤后细胞内的ROS生成。统计分析显示，对照组、缺氧损伤组、缺氧损伤+脂联素组细胞的ROS水平依次为10.00±1.00、245.98±23.52、108.23±9.51，三组细胞中的ROS水平比较差异具有统计学意义(F=196.23，P<0.001)。与对照组相比，缺氧损伤组和缺氧损伤组+脂联素组细胞内ROS水平明显升高(t=-17.37、-17.79，均P<0.001)；与缺氧损伤组相比，缺氧损伤+脂联素组细胞内的ROS水平明显降低，差异具有统计学意义(t=9.41，P<0.01，图3)。

图3 RF/6A细胞内ROS生成的荧光图像(×200)及统计学比较

3讨论

缺血性视网膜病变是一类临床常见、波及年龄范围较为广泛的复杂眼病，病理机制受到多种细胞因子、细胞外基质成分及信号网络等的紧密调控和相互作用[11]。虽然在防治方面取得了一些进展，但此类疾病多进展迅速，部分患者治疗效果并不理想，则很快进展到增殖期，带来严重的视力损害，因此研究这些视网膜病变发生进展的机制、找寻新的治疗靶点至关重要[12]。多种原因可导致局部视网膜缺血缺氧，激活缺氧诱导因子(HIF)/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路，从而导致病理性新生血管的形成[13]。近年来内源性脂肪因子与多种疾病发生的密切关系备受关注，其中脂联素的保护作用也成为研究热点[6-8]。鉴于此，我们的前期研究利用动物模型观察了脂联素对病理性视网膜新生血管形成的作用。结果显示，在小鼠氧诱导视网膜病变模型中，外源性脂联素可以明显减轻视网膜血管损伤，从而减少视网膜无灌注区，进而减少继发性病理性新生血管，证实脂联素对视网膜新生血管具有抑制作用[9]。缺血、缺氧是氧诱导视网膜病变成膜的关键机制，因此本研究进一步观察了脂联素对缺氧应激条件下视网膜内皮细胞是否具有保护作用。在本实验中，通过MTT检测发现CoCl2诱导的缺氧可明显抑制RF/6A细胞的活力，与既往研究结果一致[10]。不同浓度的脂联素预处理后可减轻CoCl2诱导的缺氧对RF/6A细胞的损伤，以50μmol/L浓度的保护作用最为显著，这与我们在高糖诱导的RF/6A细胞损伤中观察到的结果相似[14-15]，提示脂联素对应激条件下的RF/6A细胞具有保护作用，以利于维持细胞正常的生理功能。

视网膜内皮细胞是许多眼病中重要的细胞类型之一，它由视网膜血管的微血管内膜组成，广泛分布于外丛状层和神经节细胞层。视网膜血管内皮细胞的缺失是多种视网膜病变增殖前的损伤形式。多种应激因素包括缺氧、高糖等可引起视网膜内皮细胞凋亡，进而参与多种缺血性视网膜病变的发生[16]。为了进一步了解脂联素对缺氧损伤的RF/6A细胞凋亡的影响，本研究利用Western blot技术对细胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2进行了检测。Bax和Bcl-2是近年来Bcl-2蛋白家族研究中最具有代表性的促凋亡因子及抗凋亡因子。正常生理情况下，两者以Bax/Bcl-2异源二聚体形式存在。当细胞中Bax表达增多时，Bax蛋白之间相互作用形成同源二聚体，激活Caspase家族，从而促进细胞凋亡。当细胞中Bcl-2表达上调时，则促使Bax/Bax二聚体解离，生成Bax/Bcl-2二聚体增多，抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax比值决定着细胞凋亡的走向，Bcl-2/Bax比值上调，抑制细胞凋亡；Bcl-2/Bax比值下调，促进细胞凋亡[17-18]。本研究中，Western blot结果提示，缺氧损伤组RF/6A细胞的凋亡蛋白Bax和Bcl-2蛋白表达均较对照组明显上调，而Bcl-2/Bax比值明显下调，提示在缺氧条件下，细胞凋亡信号通路被激活，以促凋亡为主；脂联素预处理后凋亡蛋白Bax表达明显下调，Bcl-2蛋白表达明显上调，而Bcl-2/Bax比值显著上调，提示脂联素可抑制RF/6A细胞凋亡。以上结果与在高糖条件下观察到的脂联素抗凋亡效应一致[14]，提示脂联素可抑制缺氧等应激损伤造成的细胞凋亡，从而发挥保护细胞存活的作用。

在视网膜缺血等病理条件下，内源性抗氧化系统产生ROS和清除ROS能力之间的不平衡被扩大。氧化应激是缺血性视网膜病变的病理进程中视网膜血管内皮细胞损伤的重要机制之一，局部视网膜缺血缺氧可诱发过量的活性氧族/活性氮族(ROS/RNS)产生，进而触发多种氧化应激信号通路，影响细胞内的DNA和脂质，导致内皮细胞凋亡，直接对视网膜血管造成损伤[4,19-20]。既往动物研究显示，在小鼠氧诱导视网膜病变模型中，外源性脂联素可激活内源性一氧化氮合酶(eNOS)促进生理性一氧化氮(NO)生成，同时又能抑制ROS/RNS的产生，从而减轻视网膜血管损伤[9]。为了进一步研究脂联素对缺氧损伤的RF/6A细胞发挥保护作用的分子机制，本研究观察了脂联素对细胞中氧化应激重要指标ROS表达水平的影响。我们发现，CoCl2诱导的缺氧可导致RF/6A细胞中ROS生成明显增多，出现了明显的氧化应激表现，而脂联素预处理的RF/6A细胞中ROS生成明显降低，提示脂联素可抑制缺氧诱发的RF/6A细胞氧化应激反应。与在其他组织细胞中的研究相似，脂联素可抑制氧自由基的形成，减轻缺氧/缺血状态下心血管内皮细胞及神经元的氧化应激反应，从而保护这些细胞免受缺血性损伤[21]。

近年来，随着对内源性脂肪因子功能的关注，越来越多的研究发现脂联素可对人体起保护作用，但对其在视网膜疾病中的作用还有待研究。本研究证实，在视网膜缺氧模型中，脂联素可通过抑制ROS的形成，减轻缺氧诱导的RF/6A细胞的氧化应激反应，同时脂联素能促进细胞活力，抑制细胞凋亡，提示脂联素的血管内皮细胞保护作用机制可能与其减轻氧化应激有关，但二者之间是否为直接关系还需要进一步验证。总之，探究脂联素对缺氧损伤下的视网膜血管保护作用，不仅有助于进一步阐明缺血性视网膜病变的发病机制，也对寻找和调动内源性保护方法，减轻视网膜血管病变程度并改善疾病预后具有重要临床意义。