安晓丽， 范明智， 李学峰， 车成来， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

白色紫锥菊(Echinaceapallida(Nutt.)Nutt)为菊科松果菊属多年生药用草本植物，株高低于90 cm，花多为淡紫色[1]。原产自北美及加拿大南部等地区，我国于20世纪90年代将其作为一种药用植物进行引种，并推广栽种[2]，目前在我国北京、吉林和云南等地均已成功引种栽培[3]。白色紫锥菊是一种观赏性较好的花卉植物，也可作为药用植物长期应用于医药等领域。早在300年前，北美印第安人已将其用于治疗外伤感染、牙痛、肺结核以及各种毒蛇昆虫咬伤等病症，被当地人称之为“万灵丹”[4-5]。经研究表明，白色紫锥菊含有多种有效活性物质，包括多糖类、黄酮类及酚酸类化合物等成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等功效[6-8]，但在美白方面的研究尚少。

酪氨酸酶，普遍存在于人体及动植物中，又被称为酚氧化酶或多酚氧化酶[9]。酪氨酸酶作为黑色素形成过程中的主要限速酶，使多巴、多巴醌等产生一系列反应转化为黑色素[10]。酪氨酸酶在人体内沉积过多会引发老年斑、色素沉着斑等多种病症[11]。这些由于色素的异常积攒而造成的皮肤病已严重影响了人们的外在美观。因此，大多具有美白功效产品的主要成分多为酪氨酸酶抑制剂，其原理主要是通过调节酪氨酸酶的活性及其转录来减少黑色素的合成[12]。植物材料的提取条件对提取物中活性物质含量及生物活性具有很大的影响。因此，该试验以生物反应器培养的白色紫锥菊不定根为材料，研究了不同条件下提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响，旨在筛选出最佳提取工艺，为白色紫锥菊提取物应用于美白相关产品的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

THC-5B型数控超声提取机(中国济宁天华超声电子仪器有限公司)；R201DⅡ旋转蒸发仪(中国上海申顺生物科技有限公司)；YHW-1103远红外鼓风干燥箱(中国天津市华北实验仪器有限公司)；iMark酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 材料

参考王洪秋等[13]的培养方法扩繁白色紫锥菊不定根(图1)。

图1 生物反应器培养的白色紫锥菊不定根

取白色紫锥菊不定根30 g(鲜重)，接种于含3/4 MS+IBA 1 mg/L+蔗糖 50 g/L的生物反应器中，将pH值调为5.8，在通气量为0.075 vvm的条件下暗培养30 d。将不定根收获后，冲洗干净并进行烘干，以备试验所用。

1.3 方法

1.3.1 不同条件提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响

参照蒋晓龙等[14]的方法并稍作修改后，进行试验设计。称取不定根干品2 g，浸于80%乙醇中后，在不同提取时间、提取温度、提取次数和料液比的条件下，采用超声法(40 kHz)提取，重复3次，合并滤液后，减压浓缩，在45 ℃干燥箱中烘干。将提取时间分别设为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，在温度为50 ℃，料液比为1∶30(g∶mL)的提取条件下超声提取3次，进行提取时间试验；以提取时间试验中测定的酪氨酸酶活性的抑制率最高的时间作为提取时间，将提取温度分别设为25，30，50，70和90 ℃，在料液比为1∶30(g∶mL)的提取条件下，提取3次进行提取温度试验；以试验中测定的酪氨酸酶活性抑制率最高的时间及温度作为提取条件，将提取次数分别设置为1，2，3，4和5次，料液比为1∶30(g∶mL)进行提取次数试验；以试验中测定的酪氨酸酶活性抑制率最高的提取时间、提取温度、提取次数为提取条件，将料液比分别设为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50(g∶mL)进行料液比试验。

1.3.2 提取工艺优化研究

在以上单因素试验结果的基础上，选择提取时间、提取温度、提取次数及料液比设定4因素3水平L9(34)正交设计(表1)后，按照不同组合的提取条件对不定根进行提取，测定不同提取物处理后的酪氨酸酶活性的抑制率，以此作为评价指标确定最佳的提取工艺。

表1 L9 (34)的正交试验因素水平

1.4 酪氨酸酶活性抑制率的测定

采用多巴氧化速率法参照蒋晓龙等[14]的方法并稍作修改后测定酪氨酸酶活性。按照表2准确吸取不定根提取物溶液(1.4 mg/mL)、磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH值6.8)和1 mmol/L的L-多巴(SIGMA公司，美国)于检测板中，室温下孵化10 min后，加入50 U/mL的蘑菇酪氨酸酶(SIGMA公司，美国)溶液，5 min后用酶标仪在450 nm处测吸光值(OD)，计算酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率/% =[1-(ODA1-ODA2)/(ODA3-ODA4)]× 100%，

式中,ODA1、ODA2、ODA3和ODA4分别为表2中A1、A2、A3和A4反应液的OD值。

表2 反应液的组成

1.5 数据分析

该试验中运用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)对试验数据进行方差分析，用邓肯氏新复极差法作对比,显著水平为0.05的每个处理进行3次重复试验。

2 结果与分析

2.1 不同条件提取的提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.1.1 提取时间

在料液比为1∶30，不同的时间(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)，提取温度为50 ℃的条件下，重复3次，并探究不同时间提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响。不定根提取物在0.5～2.5 h进行提取时，酪氨酸酶活性的抑制率先升高后下降。当提取时间为1.5 h时，酪氨酸酶活性的抑制率最高(51.2%)(图2)。推测随着提取时间的增加，白色紫锥菊不定根中抑制酪氨酸酶活性的有效物质逐渐溶解，但提取时间过长，有些物质的结构会被破坏，使得酪氨酸酶活性的抑制率降低，考虑到提取效率的问题，最适宜的提取时间确定为1.5 h。

图2 不同时间提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.1.2 提取温度

在料液比为1∶30，提取时间为1.5 h，提取温度分别为25，30，50，70，90 ℃的条件下，重复3次，并探究不同温度下提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响。

由图3可知，当提取温度从25 ℃上升到70 ℃时，酪氨酸酶活性的抑制率呈上升趋势。当提取温度为70 ℃时，酪氨酸酶活性的抑制率升到最高(53.1%)。说明过低或过高的提取温度均不利于提取白色紫锥菊不定根中有效成分以及抑制酪氨酸酶的活性，因此，最佳提取温度选择70 ℃。

图3 不同温度下提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.1.3 提取次数

在料液比为1∶30，提取时间为1.5 h，提取温度为70 ℃，提取次数分别为(1，2，3，4，5次)的条件下进行提取，并探究不同次数提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响。当不定根提取物提取1～3次时，酪氨酸酶活性的抑制率随着提取次数的增加而上升。当提取3次时，酪氨酸酶活性的抑制率升至54.4%；提取次数超过3次时，酪氨酸酶活性的抑制率明显下降(图4)。因此，选择最佳提取次数为3次。

图4 不同次数提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.1.4 料液比

不同料液比提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响列于图5

图5 不同料液比提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响

在料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，提取时间为1.5 h，提取温度为70 ℃的条件下，重复提取3次，并探究不同料液比提取的不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响。当料液比在1∶10～1∶30时，酪氨酸酶活性的抑制率显著升高；料液比为1∶30和1∶40时，酪氨酸酶活性的抑制率升到最高(55.6%)(图5)。推测可能随着料液比的减小，加快了有效成分的溶出，使得白色紫锥菊不定根降低了酪氨酸酶活性；而料液比过低，则不能充分提取出有效成分。因此，确定最佳料液比为1∶30。

2.2 正交设计试验提取工艺优化

根据单因素试验结果，设定L9(34)正交试验方案，对提取时间(A)、提取温度(B)、提取次数(C)和料液比(D)4个因素进行不同组合，探究了用这些组合提取的提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响。正交试验方案及结果见表3。

由表3可知，第7组，即提取时间2 h、提取温度50 ℃、提取4次、料液比为1∶40时，酪氨酸酶活性抑制率最高(56.1%)。不同提取条件提取的提取物对酪氨酸酶活性抑制的影响不同，对极值R进行结果分析，R值由大到小的顺序排列为提取时间(A)> 提取温度(B)> 料液比(D)> 提取次数(C)，说明影响最大的是提取时间，然后依次是提取温度、料液比、提取次数。分别计算出各因素水平对酪氨酸酶活性抑制率的平均值K，其中，提取时间(A)和提取次数(C)中K3值最大，提取温度(B)和料液比(D)中K2值最大，因此，最优条件为A3B2C3D2。

表3 正交试验方案及结果

进一步对不同条件提取的提取物对酪氨酸酶活性的抑制率进行方差分析，结果表明：提取时间、提取温度和料液比差异显著(P<0.05)，但提取次数无显著性差异(表4)。因此，从经济方面考虑，正交试验得到的优化组合(A3B2C3D2)中提取次数可采用1次，优化条件为：提取时间2 h、提取温度70 ℃、提取1次、料液比1∶40。在此条件下重复3次试验，并对提取物中酪氨酸酶活性的抑制率进行调查。由表5可知，3次重复的酪氨酸酶活性抑制率差异不大，平均为57.4%，高于正交试验中第7组(A3B1C1D2,56.1%)，验证试验结果的相对标准偏差(RSD)值较小(2.1%)，表明试验结果具有稳定性。因此，白色紫锥菊不定根提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳提取条件为：提取时间2 h、提取温度70 ℃、提取1次、料液比1∶40。

表4 试验方差分析表

表5 验证试验结果

3 讨论

古往今来，美白一直是广大女性关注的热门话题。目前，大多数化妆品中所含的氧化剂及防腐剂等多为化学物质，对人体伤害较大。而植物提取物较为安全，并具有显著的美白、护肤等功效，因此，植物成分的护肤品越来越受人们青睐。人体的肤色主要取决于黑色素的含量与分布。因此，在选择美白类物质添加剂时，优先考虑能有效抑制酪氨酸酶活性的植物成分。研究发现，金线莲丛生芽提取物[15]、贯叶连翘提取物[16]和构树提取物[17]等对酪氨酸酶具有显著抑制作用，部分植物提取物已应用于美白化妆产品中。

同种植物的有效成分在不同提取条件下对酪氨酸酶活性抑制的效果不同，探究提取工艺的不断优化，可达到更大程度地抑制酪氨酸酶活性的效果。公衍玲等[18]研究了丹参叶总酚酸提取工艺，结果发现最佳提取条件中提取温度为76 ℃，此时丹参叶总酚酸提取物对酪氨酸酶活性的抑制率最高，这与该试验中筛选的最佳提取温度70 ℃相似。陈犇等[19]对七子提取工艺进行优化，结果表明最优的提取工艺中提取2 h时，七子白水提取物具有较强抑制酪氨酸酶的作用，而该试验中筛选出的最佳提取时间也为2 h。宋艳玲等[20]研究了独角莲水提物抑制酪氨酸酶活性成分的提取工艺，结果表明最佳提取条件中的提取1次时，测得的独角莲水提物对酪氨酸酶的抑制率最高，这与本试验中筛选出的提取次数一致。

4 结论

对酪氨酸酶活性抑制效果最佳的白色紫锥菊不定根提取工艺为：提取时间2 h、提取温度70 ℃、提取次数1次、料液比1∶40(g∶mL)，此时测得的酪氨酸酶活性抑制率57.4%。