牛卫东，许太彬，孙丽梅，安 戈，史 军，李 羿，赵瑞臻

（郑州市疾病预防控制中心，河南 郑州 450007）

2019年12月，武汉市出现了由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）[1]。SARS-CoV-2是一种β属冠状病毒，属于单链RNA病毒，有包膜[2]，其 基因特征与严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）有明显区别[3-4]。目前，实时荧光逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）仍是COVID-19疑似病例的主要确诊方法[5]。实时荧光RT-PCR主要检测SARS-CoV-2基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）[5]。在SARSCoV-2核酸检测过程中会出现核酸单靶标阳性的情况，虽然在最新版《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》[5]中明确了SARS-CoV-2核酸单靶标阳性的判定规则，但仍需对SARS-CoV-2核酸单靶标阳性的情况进行分析和探讨。截至2020年3月11日，郑州市疾病预防控制中心实验室针对全市COVID-19疑似患者和密切接触者共做了4 375次的SARS-CoV-2核酸检测，其中有23例COVID-19疑似患者和密切接触者首次检测（以下简称首检）出现了SARS-CoV-2核酸单靶标阳性的情况，本研究拟对这23例标本进行跟踪检测，以期为实验室检测提供参考。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集2020年1月20日—3月11日，郑州市COVID-19疑似患者、密切接触者的鼻拭子或咽拭子标本。所有标本均严格按照《新型冠状病毒肺炎防控方案》采集并转运至郑州市疾病预防控制中心微生物检验所病毒实验室。

1.2 试剂与仪器

病毒核酸提取试剂盒（EX-RNA/DNA病毒）和GeneRoteX 96全自动核酸提取仪均购自西安天隆科技有限公司。Heidolph-Multi Reax多位试管振荡器购自德国海道夫公司。Parafilm封口膜购自美国BEMIS公司。采用实时荧光RTPCR检测SARS-CoV-2，试剂盒购自上海伯杰医疗科技有限公司，检测仪器为CFX96实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 标本的处理与检测

将鼻拭子/咽拭子病毒采样管用封口膜密封后，置于试管振荡器上，振荡10 min。按照SARS-CoV-2核酸提取试剂盒说明书要求完成核酸提取，吸取5 μL标本，加入到20 μL分装好的核酸检测液中，将剩余标本置于-20 ℃保存。

实时荧光RT-PCR反应条件为：逆转录50 ℃10 min，预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃40 s，45个循环。ORF1ab基因检测通道为FAM，N基因为HEX/VIC，内参基因为ROX。

1.4 结果评价

1.4.1 质控标准 在同一检测中必须同时满足：阳性对照3个通道扩增循环阈值（cycle threshold，Ct）均≤30，阴性对照均无Ct值，否则本次检测无效。

1.4.2 结果判读 若ROX通道Ct值>38，则判定标本不合格。若ROX通道Ct值≤38，FAM通道、HEX/VIC通道均无Ct值，则判定为阴性。FAM通道、HEX/VIC通道Ct值≤38，则判定为阳性。FAM通道、HEX/VIC通道均有Ct值，且有Ct值>38，或仅有单个通道出现明显扩增曲线时，判定为不确定，建议复测。本研究以仅单个通道出现明显扩增曲线作为单靶标阳性。对单靶标阳性的标本，重新采样检测间隔时间不少于24 h。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；如果<5的预期值>总数的1/5，且样本数<40，则用Fisher精确概率法进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测概况

对23例首检为SARS-CoV-2核酸单靶标阳性者重新采样检测，其中有8例（34.78%）SARSCoV-2核酸为阳性，15例（65.22%）为阴性。见表1。

2.2 重新采样检测阳性率

在23例首检为SARS-CoV-2核酸单靶标阳性的标本中，有6例为ORF1ab基因单靶标阳性，占26.09%，其中有1例重新采样检测后被确认为阳性，重新采样检测阳性率为16.67%；有17例为N基因单靶标阳性，占73.91%，其中有7例重新采样检测后被确认为阳性，重新采样检测阳性率为41.18%。2个基因之间重新采样检测阳性率差异无统计学意义（χ2=1.174，P>0.05）。见表2。

2.3 检测次数

从整体来看，23例COVID-19疑似患者和密切接触者中，有16例进行了2次采样检测，6例进行了3次采样检测，1例进行了5次采样检测，方得到最终可判定的结果。从基因型别来看，6例ORF1ab基因单靶标阳性者均进行了2次采样检测，方得到最终可判定结果；17例N基因单靶标阳性者中，10例进行2次采样检测，6例进行3次采样检测，1例进行了5次采样检测，方得到最终可判定的结果。从最终确诊情况来看，8例确认为SARS -CoV-2核酸阳性的患者中，7例进行了2次采样检测，1例进行了3次采样检测；15例SARS-CoV-2核酸阴性者中，9例进行了2次采样检测，5例进行了3次采样检测，1例进行了5次采样检测。如果按最新版检测方案[5]判定，将会产生6例假阳性结果，6例均为N基因单靶标阳性。见表2。

表1 23例SARS-CoV-2核酸单靶标阳性者跟踪检测Ct值结果

2.4 Ct值分布

首检单靶标阳性标本整体的C t值为36.00～36.99时出现高峰，首检ORF1ab基因单靶标阳性的Ct值集中分布于36.00～38.00。首检单靶标阳性转阳标本的Ct值分布比较分散。有1例Ct值为40.68的标本在第2次检测后被确认为阳性。见图1。

表2 得到最终可判定的结果所用检测次数 例

图1 SARS-CoV-2核酸单靶标阳性标本Ct值分布

3 讨论

自2019年12月COVID-19疫情在武汉暴发以来，涌现出了各种针对SARS-CoV-2的检测方法，但实时荧光RT-PCR仍是COVID-19的主要确诊方法[5]。按照相关试剂盒说明书要求，单靶标阳性标本应该判定为不确定。本研究对23例首检单靶标阳性标本的跟踪检测结果显示，有34.78%的单靶标阳性标本在跟踪检测中被确认为阳性。提示单靶标阳性标本应该进行跟踪检测，以免造成假阴性结果，增加疫情扩散风险。

COVID-19疫情突然暴发，临床检测需求增加，但很多检测试剂的灵敏度、稳定性和可靠性还有待进一步验证[6]，有些试剂ORF1ab基因和N基因的检测灵敏度之间有差异，可能会出现单靶标阳性结果[7]。还有研究结果显示，实时荧光定量PCR检测N基因的灵敏度更高[8]。有研究结果显示，COVID-19潜伏期长达14 d，在感染早期临床表现不典型[9]，病毒复制数量达不到试剂盒检测阈值时，可能会出现假阴性或单靶标阳性[10]。

假阴性和单靶标阳性结果的出现也可能与标本采集质量有关[10]，大量非呼吸专业医护人员不熟悉鼻/咽拭子的采集规范，可能会造成采集部位不准确[10]、采集手法不到位等情况，影响采集标本的质量。还有研究表明，痰液的检出率明显高于鼻/咽拭子，说明多种标本同时采集可以提高新冠病毒检出率[11]。

ORF1ab基因中序列同一性在SARS-CoV-2和乙型冠状病毒其他成员之间<90%，是区分SARS-CoV-2与其他冠状病毒的重要靶标[4]，ORF1ab基因特异性强，因此23例单靶标阳性标本中，仅有6例为ORF1ab基因单靶标阳性。

在冠状病毒的结构蛋白中，N蛋白是最保守和最稳定的蛋白，因此N基因相对保守[4，12]，易与其他发生交叉反应，因此一些试剂检测N基因的灵敏度更高[8]。23例单靶阳性标本中，73.91%为N基因单靶标阳性，且有10例转为阴性，可能是与其他病毒发生交叉反应。N基因单靶标阳性标本中有7例转为阳性，重新采样检测阳性率为41.18%。

从整体的检测次数来看，绝大多数首检单靶标阳性者在连续2次跟踪检测后，就能够得到明确结果，但仍有部分单靶标阳性者需要检测3～5次。多次检测后，N基因仍出现单靶标阳性者也可能是其他冠状病毒感染[13]。按照《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中实验室确认阳性标本的标准，23例单靶标阳性的标本中将出现6例假阳性标本，且6例假阳性标本均为N基因单靶标阳性，提示同种类型标本2次采样检测中均出现单靶标阳性的检测结果时，应该慎重对待，并重新采样跟踪检测。

从重新采样检测阳性标本的Ct值分布来看，有1例Ct值为40.68的首检单靶标阳性标本在第2次检测时被确认为阳性，提示单靶标阳性标本的Ct值不论是高是低均应重新采样检测。